基于SRAP分子标记的24个黑木耳栽培菌株遗传分析

史灵燕 张云龙 刘保卫 郑素月

（河北工程大学园林与生态工程学院，河北邯郸056021）

黑木耳（Auriculariaauricular）又名木耳、光木耳、云耳、黑耳子等，是我国著名的食用菌，食药用价值高，在我国栽培历史悠久。随着食用菌市场的发展，现存市场相互引种频繁，私自命名菌种繁多，种源不清，名称混乱，菌种混乱问题日益严重，菌种纠纷频发，而食用菌产业在菌种知识产权保护方面意识较弱，菌种保护管理制度也不够健全。随着分子标记技术的快速发展，利用分子标记鉴定不同地区、不同黑木耳菌株的研究报道越来越多[1-5]，而利用SRAP（sequence-relatedamplifiedpolymorphism）分子标记鉴定生产中不同黑木耳菌株亲缘关系的研究较少[1，6]。

SRAP分子标记是一种基于PCR的新型分子标记系统，目前广泛地应用于植物的物种遗传多样性和亲缘关系分析。相对于其他分子标记方法，SRAP分子标记在植物物种的遗传多样性和亲缘关系分析中能获得更多的信息[7]。该标记具有简便、稳定、高重复率、便于克隆目标片段的特点，并已被应用于图谱构建性状的标记和遗传多样性分析[8]。SRAP标记技术已在木耳、平菇、香菇、灵芝、金针菇、鸡腿菇、双孢蘑菇、大球盖菇等食用菌遗传多样性分析和亲缘关系分析上得到应用[7，9-15]。笔者采用SRAP分子标记，对收集到的北方地区24株栽培中常用的黑木耳菌株进行遗传多样性分析，明确其菌株间的亲缘关系，以期为生产上黑木耳菌株的选择、菌种管理及其栽培育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黑木耳菌株主要来源于东北黑龙江、吉林、辽宁地区及河北平泉地区，详见表1。

表1 供试黑木耳菌株及来源

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取、扩增和电泳检测

将菌种活化后接种于平板上，25℃条件下进行隔膜培养。7d后取120mg新鲜菌丝体，液氮研磨成粉末，用植物基因组DNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取DNA，1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分光光度计测定DNA浓度和质量，稀释成50ng/µL，置于-20℃冰箱中备用。

1.2.2 SRAP扩增反应体系

20µL反应体系中，2×TapPCRMasterMix 10µL，上、下游引物各1µL，模板DNA1µL，用ddH2O补足体积。

SRAP扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，80V恒压电泳45min，紫外凝胶成像系统观察并拍照。

1.2.3 SRAP标记引物序列

SRAP引物序列见表2，由上海生工生物工程股份有限公司合成，设计上游引物6条，下游引物8条，随机组成48对引物组合。

表2 SRAP分子标记引物序列表

1.2.4 数据处理

电泳结果采取0/1赋值记带，将在琼脂糖凝胶上出现DNA片段的记为1，不出现的记为0，统计后输入电脑，用聚类分析软件NTsys进行聚类分析，并计算遗传相似度。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA检测

DNA电泳检测结果见图1。电泳条带清晰且亮度高，说明所提取的DNA纯度高，可以进行后续的研究工作。

图1 部分黑木耳菌株基因组DNA图谱

2.2 引物筛选结果

选择较广泛栽培的黑木耳黑丰菌株DNA对48对引物组合进行初步筛选，图2为48对SRAP引物组合对黑木耳菌株扩增的指纹图谱。结果表明，有25对SRAP引物都能清晰地扩增出条带，且条带较多。每对引物组合样本的扩增带数目在2～9条不等，平均每对引物扩增条带6条，说明本体系扩增效率较高。用筛选出的背景和条带都比较清晰的25对引物组合分别对供试的24个黑木耳菌株DNA进行扩增。25对引物分别为：Me1-Em2，Me1-Em3，Me1-Em4，Me1-Em7，Me1-Em，8；Me2-Em1，Me2-Em1，Me2-Em3，Me2-Em4，Me2-Em7；Me3-Em2，Me3-Em3，Me3-Em4；Me4-Em1，Me4-Em3，Me4-Em5，Me4-Em7；Me5-Em2，Me5-Em2，Me5-Em4，Me5-Em5，Me5-Em6，Me5-Em7；Me6-Em6，Me6-Em7。

2.3 黑木耳菌株的SRAP指纹图谱分析

25对引物对24个黑木耳菌株共扩增出133个位点，片段大小在0.1～1.5kb，平均每条引物的扩增位点为6个，其中多态性位点59个，平均多态性比率为40.5%（表3），部分引物对的SRAP-PCR的扩增图谱见图3和图4。24个菌株的聚类分析结果见图5所示，结果表明，供试的24个黑木耳菌株遗传相似系数在0.56～1.0，当遗传相似系数在0.56时，24个黑木耳菌株分为2大类；第一类包括黑丰、黑29、黑威15号、大筋王、黑耳厚、厚筋6个菌株，其余黑威单片、黑威伴金、瑞宝、海元、黑三角等18个菌株为第二类菌株，说明每一类中这些菌株的遗传背景相似，亲缘关系比较近。其中，黑威15号、黑29和厚筋、黑耳厚、大筋王、黑丰之间的相似水平达98%；UR38、UR87、黑山与黑威单片、黑威伴金、瑞宝等15株菌株之间的相似水平也高达99%，表明其遗传背景相近，也可能是由于市场混乱，属于互相引种的同一个品种。

图2 SRAP标记引物筛选扩增图谱

图3 Me4-Em3引物对扩增黑木耳菌株DNA图谱

图4 Me4-Em7引物对扩增黑木耳菌株DNA图谱

表3 SRAP-PCR扩增条带统计

图5 24个黑木耳菌株的SRAP聚类分析图

3 小结与讨论

SRAP标记是一种基于PCR的新型标记系统，通过正反向引物对ORFs区域中内含子、启动子进行特异扩增，因不同物种以及个体内含子、启动子与间隔区序列长度不等而产生多态性[16]。研究利用SRAP分子标记法鉴定生产中常用的黑木耳菌株，具有重复性好，操作简单，引物具有通用性，正反向引物可自由组合成引物对，引物使用率高，引物合成成本低的特点[17]，但与ISSR分子标记相比多态性较低[18]。SRAP技术目前广泛应用于食用菌的菌株分子鉴定、分类学研究、遗传多样性及亲缘关系分析等方面[7，9-15]，为食用菌遗传学研究和育种提供了依据。刘华晶等[9]利用SRAP技术对大兴安岭地区野生黑木耳菌株进行遗传多样性分析。利用SRAP法对黑木耳生产菌株进行鉴定和遗传分析，旨在澄清黑木耳市场菌种混杂退化，解决生产中常用黑木耳菌株的同物异名和同名异物的问题。本研究中，从生产中收集的24株黑木耳菌株经SRAP分子鉴定，PCR扩增获得133个扩增位点，片段大小0.1～2.0kb，平均每条引物的扩增位点为6个，25对引物的133个扩增位点中，59个位点具多态性，平均多态性比率为40.5%，多态性丰富度较低；在遗传系数0.56时分为了两大类，第一类包括黑丰、黑29、黑威15号、大筋王、黑耳厚、厚筋6个菌株；第二类包括黑山与黑威单片、黑威伴金、瑞宝等18个黑木耳菌株。而黑29与黑威15号、厚筋与黑耳厚、大筋王、黑丰；UR38、UR87、黑山及其余15株菌株的遗传相似系数为1.0，表明它们相互间不存在遗传差异。

经SRAP分子标记技术鉴定生产中常用黑木耳菌株，结果表明生产中常用的黑木耳栽培菌株多态性较低，聚类分析分类也较少，从而进一步说明了生产中黑木耳栽培菌株存在同物异名现象。