腺苷脱氨酶检测对结核性腹膜炎的诊断价值

李静 马异峰 逄宇 王卓 王晓琳 封婧 仵倩红

结核性腹膜炎(tuberculous peritonitis，TBP)是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性弥漫性腹膜感染，是一种常见的腹腔结核，多继发于腹膜外结核，占肺外结核的12%[1-2]，且伴随着腹腔结核的增加而呈增多趋势[3-6]。但因其临床表现复杂多样、缺乏特异性、多并发其他疾病，且无确定性实验室检测方法，易被漏诊和误诊而延误诊治，故早期诊断TBP对有效治疗和降低死亡率非常重要[7-8]。

传统的细菌学和病理学检测一直是结核病诊断的金标准，但因抗酸杆菌(AFB)涂片镜检阳性检出率低、培养周期长、病理取材有创伤，故寻求新的快速、准确且高敏感度和高特异度的TBP诊断方法成为结核病检测工作的重要目标。尽管2013年GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)检测作为新型分子诊断技术被WHO推荐用于肺外结核的诊断[9]，但其对腹腔积液中结核分枝杆菌的检出率仍然很低[10]；而腺苷脱氨酶(ADA)检测已被大量研究证实对于结核性胸腔积液、脑脊液和心包积液等肺外标本也具有较高的辅助诊断价值[10-11]，但对腹腔积液的研究报道却很少。笔者通过分析AFB涂片、BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960培养”)、GeneXpert和ADA检测对TBP的诊断效能，进一步评估腹腔积液行ADA不同截断值对TBP的诊断价值。

资料和方法

一、研究对象

收集2016年1月至2018年12月陕西省结核病防治院和北京胸科医院收治的203例疑似TBP患者腹腔积液标本的实验室检测资料，纳入同时采用抗酸杆菌金胺O染色涂片镜检(简称“AFB涂片”)、MGIT 960培养、GeneXpert和ADA检测的119例疑似TBP患者，其中73例(61.3%)确诊为TBP患者(TBP组)中，男36例(49.3%)、女37例(50.7%)；年龄范围14～87岁，其中<25岁年龄组29例(39.7%)、25～岁年龄组17例(23.3%)、45～岁年龄组18例(24.7%)、65～87岁年龄组9例(12.3%)。46例(38.7%)确诊为非结核性腹膜炎(非TBP组)患者，包括腺癌、鳞癌、低分化癌、结肠癌共计21例，肺结核并发非结核分枝杆菌病2例，急性血行播散性肺结核2例，继发性肺结核3例，肠结核1例，结核性心包炎1例，结核性多浆膜腔积液6例，胸膜炎、脑膜炎共10例；其中男22例(47.8%)、女24例(52.2%)，年龄范围19～85岁，其中<25岁年龄组4例(8.7%)、25～岁年龄组12例(26.1%)、45～岁年龄组17例(36.9%)、65～85岁年龄组13例(28.3%)。以临床确诊患者为标准，评价AFB涂片、MGIT 960培养、GereXpert和ADA检测的检测效能。

二、诊断标准[12-13]

1.疑似TBP诊断标准：(1)中青年患者，有结核病病史，并发其他器官结核病且诊断证据确凿；(2)原因不明发热达2周以上，伴有腹痛、腹胀、腹泻、腹腔积液、腹壁柔韧感或腹部肿块；(3)腹腔积液为渗出性，以淋巴细胞为主，普通细菌培养阴性，ADA检测明显高于临床参考范围；(4)结核菌素皮肤试验(TST)强阳性或γ干扰素释放试验(interferon-γ release assay，IGRA)阳性；(5)腹部X线摄影或CT扫描发现腹膜增厚、肠系膜结节、淋巴结增大、肠粘连等征象。符合以上临床诊断标准其中一项即为可疑TBP患者。

2.TBP确诊标准：腹腔积液结核分枝杆菌培养阳性，或临床诊断为疑似TBP患者经试验性抗结核药物治疗2～4周有效。

3.其他疾病诊断：参照《内科学》和临床诊疗路径，结合临床症状、实验室检测、影像学和病理学检查，以及诊断性治疗有效可确诊。

三、主要试剂和仪器

抗酸染色试剂为自配金胺O染色试剂；BACTEC MGIT 960检测系统所用的培养仪及试剂均由美国BD公司提供；GeneXpert检测系统及配套试剂盒均购于美国Cepheid公司；腹腔积液ADA测定采用贝克曼AU 2700全自动生化分析仪及配套试剂检测。

四、检测方法

腹腔积液标本按照无菌采集标本的要求留取。

1.AFB涂片：严格按照《结核病实验室检验规程》[14]操作。将腹腔积液标本静置2～4 h，取沉淀部分约20～50 ml，3000×g离心20～30 min，取沉淀物涂片、干燥、抗酸染色镜检，按照检验规程报告结果。

2.MGIT 960培养：严格按照《结核病实验室检验规程》[14]操作。取2 ml腹腔积液标本经N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠法(NALC-NaOH，终浓度为1.5%)消化去污处理后，室温静置15 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)中和(pH=6.8)后再3000×g离心15 min，弃上清，2 ml PBS缓冲液重悬沉淀物，取0.5 ml重悬液接种至MGIT 960培养管中，加入0.8 ml 营养添加剂(OADC)和杂菌抑制剂(PANTA)的混合液，严格按照说明书进行操作。将接种好的MGIT 960培养管放入MGIT 960系统中孵育，仪器对分枝杆菌的生长进行自动监测。仪器报阳后采用结核分枝杆菌抗原检测试剂盒(MPB64)进行结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步鉴定[15]。

3.GeneXpert检测：严格按照说明书进行检验。将1 ml腹腔积液标本与2 ml GeneXpert系统前处理液混合，室温静置15 min。将消化后的2 ml样品用无菌吸管吸入GeneXpert系统测试盒中，上机检测，约2 h报告结果。

4.ADA测定：吸取腹腔积液标本2 ml，3000×g离心5 min，直接放入全自动生化仪进行检测(酶比色法)，自动报告结果。正常参考范围为40 U/L，本研究经ROC曲线分析，确定在敏感度最大时的ADA测定值(31.45 U/L)为阳性临界值，以高于31.45 U/L为阳性，低于31.45 U/L为阴性。

五、统计学处理

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。以临床确诊患者为参考标准，评价AFB涂片、MGIT 960培养、GeneXpert和ADA测定的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值、符合率。组间率的比较采用χ2检验，ADA测定值的比较采用t检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。以ROC曲线分析ADA检测的最佳临界值，以ROC曲线下面积(AUC)评估检测效能，AUC值越大，说明检测的诊断价值越大。当AUC值接近0.50时表示检测对诊断无临床意义；AUC值为0.50～0.70时表示诊断准确度较低；AUC值为0.70～0.90时表示诊断准确度为中等；AUC值>0.90表示诊断准确度较高。

结 果

一、不同检测方法对TBP的检出情况

119例疑似TPB患者中，AFB涂片、MGIT 960培养和GeneXpert检测疑似TBP患者的阳性检出者均为TPB患者，阳性率分别为2.5% (3/119)、6.7% (8/119)、7.6% (9/119)，且MGIT 960培养和GeneXpert检测TBP有6例患者是一致的；而ADA检测疑似TBP患者的阳性检出率为58.8% (70/119)，但70例阳性检出者中TBP患者63例、非TBP患者7例。且63例TBP患者中ADA分别检出55例MGIT 960培养和54例GeneXpert检测阴性患者。

二、AFB涂片、MGIT 960培养、GeneXpert、ADA检测对TBP的检测效能

119例疑似TPB患者中，以临床确诊患者为标准，不同检测方法及ADA测定对TBP的检测效能见表1，ADA的敏感度高于其他3种检测方法。对ADA测定值进行ROC曲线分析，显示当腹腔积液ADA阳性临界值为31.45 U/L时，敏感度为86.3% (63/73)，特异度为84.8%，AUC曲线下最大面积为0.836，见图1。

图1 ADA测定诊断TBP的ROC曲线

表1 不同检测方法对TBP的检测效能

三、ADA测定对TBP患者的检测价值

TBP组的ADA阳性检出率(86.3%)、ADA的平均值水平[(67.66±8.59)U/L]均高于非TBP组[分别为15.2%,(17.34±2.76)U/L]，差异均有统计学意义，具体见表2。

表2 ADA检测结果对TBP患者和非TBP患者的检测价值

讨 论

TBP是由结核分枝杆菌引起的弥漫性腹膜感染，大多继发于其他部位的结核病灶，包括腹腔病灶直接蔓延感染、血行感染，但临床上多数患者无法找到原发病灶。TBP的诊断依赖于胸腔积液的病原学或病理学检测，然而传统的抗酸杆菌涂片镜检及培养阳性检出率基本低至10%[16]，本研究中AFB涂片阳性检出率为2.5%，MGIT 960培养为6.7%，与上述研究相符，不利于TBP的诊断；且由于结核分枝杆菌培养的环境要求较高，传统的L-J(罗氏)培养结果需45 d[17]，即使MGIT 960培养也至少需要2～3周[17-18]，均无法满足临床快速诊治的需求。而GeneXpert作为新型分子诊断技术，其在肺外结核中的诊断价值已被多项研究评估[19-25]，认为应用GeneXpert检测胸腔积液、脑脊液、尿液及骨关节结核部位脓液标本具有较高的敏感度和检测方法的优越性，被认为可用于肺外结核各种类型临床标本(如脑脊液和组织样本)检测的确证性诊断试验，但由于其检测效果不理想，临床中很少将其用于检测疑似TBP患者的腹腔积液[26-27]，故缺乏对腹腔积液标本的评估。本研究119例疑似TBP患者的腹腔积液标本，GeneXpert阳性检出率很低，仅为7.6%，虽然稍高于AFB涂片和MGIT 960培养，但仍难以对TBP进行辅助诊断，分析原因可能为抗酸染色涂片需抗酸杆菌达到5×103～1×104个/ml的浓度才能检测出阳性结果，而涂片样本量一般难以达到检测需求量；而MGIT 960培养对环境要求极高，前处理过程复杂、人为影响因素较多且最终加样培养量仅有较低的500 μl载菌量，也难有较高的检出率；GeneXpert虽操作过程简单，但加样量也只有1 ml，载菌量也较低[14]。另外，本研究中有2例培养阳性但GeneXpert阴性的结果，这可能与GeneXpert主要检测的是结核分枝杆菌的DNA，而MGIT 960培养主要检测活的结核分枝杆菌，且MGIT 960培养与GeneXpert的细菌浓度阳性阈值检测限也不相同(前者为100个/ml，后者为131个/ml)。同时结果还显示，MGIT 960培养和GeneXpert的检测阳性者有6例为同时阳性，重叠比例较高。故认为目前不建议应用GeneXpert检测腹腔积液，更无需进行MGIT 960培养和GeneXpert的联合检测，如何高效应用GeneXpert检测腹腔积液标本还需要进一步研究。

抗结核感染免疫仍主要依赖细胞免疫。结核分枝杆菌感染机体后激活单核巨噬细胞系统使巨噬细胞活化、淋巴细胞增殖、巨噬细胞胞体内溶酶体酶大量增多，并产生非保护性抗体，对细胞内结核分枝杆菌的杀伤力起到增强作用，故TBP是在腹膜感染结核分枝杆菌后而引起的一系列以淋巴细胞为免疫主导作用的变态反应性疾病，由于临床表现缺乏特异性，又常以腹腔积液为主要体征，故腹腔积液生物标志物的检测具有重要意义。ADA是嘌呤腺苷分解代谢过程中一种重要酶类，为特异性催化水解核苷生成肌苷核氨，在人体各器官组织中广泛分布，尤其以淋巴细胞特别是T淋巴细胞中含量最高，且与T淋巴细胞分化程度呈正比。当结核分枝杆菌抗原刺激T淋巴细胞时，腹腔积液ADA活性增高[28]，故利用ADA测定可以反映结核分枝杆菌抗原的生化反应，从而获得结核分枝杆菌的载荷量，具有较高的诊断意义，被认为是诊断TBP较为特异的指标，但阳性临界值不同，其检测的敏感度和特异度也不同，临床上一般以ADA>40 U/L为阳性临界值。一项Meta分析显示，当以ADA>40 U/L为阳性临界值时，ADA诊断TBP的敏感度和特异度分别为93%和94%[29]；而Kang等[30]研究发现，当以ADA>21 U/L 为最佳阳性临界值时，其检测特异度及敏感度分别为85%和92%；另外，Riquelme等[31]的Meta 分析报道，当以36～40 U/L为临界值时，ADA检测的敏感度和特异度最高，分别为100%和97%。本研究对ADA测定值进行ROC曲线分析结果显示，当以ADA>31.45 U/L为阳性临界值时，检测的敏感度和特异度分别为86.3%和84.8%，说明相较于GeneXpert和MGIT 960培养，腹腔积液标本中ADA的测定对诊断TBP具有较高的敏感度，可以识别大约86.3%的TBP患者，提示其在TBP的诊断中有较高的诊断价值，但较上述研究结果低，可能与检测ADA的仪器所设定的阳性界值不同、试剂来源不同、实验方法不同而影响TBP的临床诊断标准，进而影响其检测的敏感度和特异度；而且，临床上有些TBP患者在检测ADA时已进行诊断性抗结核药物治疗，使得腹腔积液中ADA水平有所降低，继而影响其特异度。在临床上TBP缺乏特异性临床表现和体征，依据ADA水平的变化并结合抗结核药物治疗的效果可鉴别诊断TBP和其他疾病。本研究MGIT 960培养和GeneXpert检测TBP阴性的患者中，ADA测定可检出75.3% (55/73)和74.0% (54/73)的TBP患者，进一步说明ADA具有更好的检测阳性反应。

本研究也存在一定的局限性。其一，虽然纳入了两家医院的患者，但是TBP患者样本量仍然较小。其二，有研究表明，与HIV初发患者相比，HIV感染患者的ADA水平可能较低[32]，但考虑到我国目前HIV感染报告率还较低，本研究未纳入HIV阳性患者进行研究。

综上所述，ADA测定对TBP早期诊断具有较高的敏感度和特异度，GeneXpert检测腹腔积液标本的阳性率高于传统的抗酸染色涂片镜检和培养，但因其检测量只有1 ml，可能导致结核分枝杆菌荷菌量较低从而降低检测敏感度。而ADA测定简单快速，与常规生化检测同时进行，当天即可回报结果，适合所有开展常规生化检测的基层单位开展，对患者的早期诊断，早期治疗，避免不必要的检查，节省大量医疗经济成本，降低漏诊和死亡率意义重大。