miR-9靶向FOXP1对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的作用及机制研究

2019-12-16 08:15闻淑娟张珍连李姗胡欣朱琳阿孜古丽·麦合麦提杨顺娥
中国当代医药 2019年30期
关键词:母细胞靶标淋巴

闻淑娟 张珍连 李姗 胡欣 朱琳 阿孜古丽·麦合麦提 杨顺娥

[摘要]目的 探讨FOXP1上游靶标miR-9对弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞的作用及机制。方法 Targetscan分析miR-9与FOXP1的结合,miR-9与FOXP1结合通过荧光素酶基因报告实验验证;以转染mimic Con为对照组,转染mimic miR-9过表达miR-9后,Western blot检测FOXP1表达变化;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测人DLBCL细胞OCI-Ly3和人B淋巴母细胞IM9中miR-9的表达水平;过表达miR-9后,体外检测OCI-Ly3的增殖以及侵袭能力的变化。结果 转染miR-9后,mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT组的荧光素酶活性低于转染mimic Con+FOXP1 3′UTR WT组,差异有统计学意义(P<0.0001);过表达miR-9后,mimic miR-9组的FOXP1表达水平低于mimic Con组,差异有统计学意义(P<0.05);miR-9在人DLBCL细胞系OCI-Ly3细胞中的表达水平低于B淋巴母细胞,差异有统计学意义(P<0.05);过表达miR-9后,OCI-Ly3细胞的增殖和侵袭能力低于mimic Con组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-9下调通过靶向FOXP1促进弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的增殖和侵袭。

[关键词]弥漫性大B细胞淋巴瘤;miRNA;miR-9;FOXP1

[中图分类号] R733.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721(2019)10(c)-0007-05

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of FOXP1 upstream target miR-9 on diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cells. Methods Targetscan was used to analyze the binding of miR-9 to FOXP1, the luciferase gene reporter assay confirmed the binding of miR-9 to FOXP1. Transfection mimic Con was used as the control group, after transfection of mimic miR-9 after overexpression of miR-9, FOXP1 expression was detected by Western blot. The real-time fluorogenic quantitative PCR (RT-PCR) was used to detect the expression level of miR-9 in human DLBCL cells OCI-Ly3 and B lymphoblastic cell IM9. After overexpression of miR-9, the proliferation and invasion ability of OCI-Ly3 were detected in vitro. Results After transfection with miR-9, the luciferase activity of the mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT group was lower than that in the mimic Con+FOXP1 3′UTR WT group, the difference was statistically significant (P<0.0001). After overexpression of miR-9, the FOXP1 expression level of mimic miR-9 group was lower than that in the mimic Con group, the difference was statistically significant (P<0.05). The expression level of miR-9 in human DLBCL cell line OCI-Ly3 was lower than that of B lymphocyte, the difference was statistically significant (P<0.05). After overexpression of miR-9, OCI-Ly3 cells had lower proliferation and invasion ability than those in the mimic Con group, the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion Down-regulation of miR-9 promotes proliferation and invasion of diffuse large B-cell lymphoma cells by targeting FOXP1.

[Key words] Diffuse large B-cell lymphoma; miRNA; miR-9; FOXP1

彌漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma,NHLs)的30%~40%,是常见的淋巴系统恶性肿瘤之一[1]。所有年龄组中都检测得到DLBCL,包括儿科患者,然而,随着患者年龄的增长,DLBCL 发病率也增加,70岁以上患者最常见。男性DLBCL的发病率相对高于女性[2-3]。DLBCLs的生物学特性、基因突变和免疫表型多种多样,直到现在,DLBCL的发病机制仍然很不清楚[4]。

miRNA是具有单链的非编码RNA分子[5]。miRNA可以促进其靶向的mRNA降解,干扰翻译过程发挥基因表达的调控作用[6]。miRNA在几乎所有细胞过程中都具有重要作用,它们在细胞增殖分化等许多细胞过程发挥作用[7]。近年来,研究发现miRNA已成为癌症进展中的重要参与者。miRNA可以抑制或促进肿瘤的发生发展[8]。例如,过表达的miR-142-5p可以抑制胰腺癌的生长[9];miR-187靶向MAPK12抑制骨肉瘤的生长;免疫反应中,miR-424通过T细胞调节上皮性卵巢癌的化疗耐药性[10]。miR-9的表达与细胞分化、增殖、迁移和转移紧密相关。在多种癌症中观察到miR-9的异常表达[11],表明miR-9参与癌症的发生。然而,目前有关miR-9在DLBCL中的作用尚不确定。

本研究通过miRNA靶基因预测软件Targetscan数据库预测FOXP1上游靶标分子miR-9,检测DLBCL细胞OCI-Ly3中miR-9的表达水平,并测试miR-9对OCI-Ly3增殖和侵袭能力的影响,探究miR-9对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的作用及机制,现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

DLBCL细胞系OCI-Ly3(上海拜力生物有限科技公司);人B淋巴母细胞系IM9(武汉尚码生物科技有限公司);RPMI1640(sigma);FBS(杭州四季青);miR-9及U6特异性引物(广州锐博生物科技有限公司);mimic miR-9(广州锐博生物科技有限公司);FOXP1抗体(proteintech);PCR试剂盒(Vazyme Biotech)。

1.2方法

1.2.1细胞培养  DLBCL细胞系OCI-Ly3和人B淋巴母细胞系IM9在37℃细胞恒温箱中孵育,RPMI1640补充有10%(V/V)的FBS、青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 U/ml)。

1.2.2实时荧光定量  实时荧光定量PCR(RT-PCR)TRIzol法提取总RNA。使用PCR试剂盒逆转录miR-9。之后,使用RT-PCR检测成熟miR-9的表达,使用U6特异性引物作为内参。

1.2.3荧光素酶基因报告实验  根据Targetscan软件预测miR-9与FOXP1 mRNA 3′-UTR区结合序列。将含该结合位点的片段插入到荧光素酶报告基因质粒。构建两组质粒:包含该结合位点的野生型质粒(FOXP1 3′UTR WT)以及突变该结合位点的突变质粒(FOXP1 3′UTR Mut)。转染OCL-LY-3细胞miR-9 mimic和两组质粒,摩尔比为50∶1。miRNA对照用作阴性对照。24 h后根据说明书(Promega,E2920),测定荧光素酶活性。

1.2.4 miR-9转染  将OCI-Ly3细胞系铺板,根据锐博生物科技公司提供的说明书,使用lipofectamine 2000进行转染,mimic miR-9用于过表达miR-9,对照组转染mimic Con。24~48 h后进行后续实验。

1.2.5细胞增殖检测  对转染miR-9 mimic的OCI-Ly3细胞进行细胞增殖检测,检测起点记为0 h,分别在0、6、12、24 h收集细胞,实验血球计数板进行细胞计数。

1.2.6细胞侵袭能力检测  使用Transwell进行体外细胞侵袭实验。简而言之,Transwell小室PVDF膜上用基质胶与处理,细胞恒温箱中平衡2 h。PBS清洗1遍,在Transwell内室加入细胞悬液(1×105细胞/孔),恒温箱中孵育24 h。轻轻擦去靠近内侧细胞,另用甲醛室温固定30 min,结晶紫染色20 min,PBS洗3遍,显微镜下进行细胞计数。每组设三复孔。

1.2.7 Western blot分析  RIPA裂解液裂解细胞,在冰上提取总蛋白;于4℃条件下,12 000 g离心20 min;BCA蛋白定量;12%十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝膠电泳分离蛋白,湿转法制得PVDF膜;用TBST洗涤PVDF膜3次,每次15 min;5%脱脂牛奶室温封闭2 h;加入一抗(FOXP1,1∶1000),4℃过夜;用TBST洗涤3次,每次15 min;室温孵育二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗,1∶2000)2 h;用TBST洗涤3次,每次15 min;用化学发光显色法显影,拍照统计。

1.3实验分组

分组包括如下:①荧光素基因报告实验分组,包括mimic Con+FOXP1 3′UTR WT组、mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT组、mimic Con+FOXP1 3′UTR Mut组及mimic miR-9+FOXP1 3′UTR Mut组。②miR-9对FOXP1表达调控作用验证分组,包括mimic Con组及mimic miR-9组。③miR-9在人DLBCL细胞OCI-Ly3和人B淋巴母细胞IM9中表达水平验证分组,包括B淋巴母细胞组及人DLBCL组。④miR-9对OCI-Ly3细胞体外增殖以及侵袭能力的作用验证:mimic Con组,mimic miR-9组。

1.4观察指标

本研究观察指标包括:①比较mimic Con+FOXP1 3′UTR WT组与mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT组的荧光素酶活性,荧光素酶活性降低降低,表明miR-9与FOXP1结合;②比较mimic Con组与mimic miR-9组的FOXP1表达水平,FOXP1表达水平降低,表明miR-9抑制FOXP1表达;③比较人DLBCL细胞OCI-Ly3和人B淋巴母细胞IM9中miR-9的表达水平;④比较mimic Con组与mimic miR-9组OCI-Ly3细胞增殖数目以及穿过Transwell的细胞数目,细胞计数降低,表明miR-9抑制OCI-ly3细胞体外增殖和侵袭。

1.5统计学方法

采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 miR-9与FOXP1结合

利用miRNA靶基因预测软件Targetscan预测出miR-9与FOXP1直接结合,预测结果见图1,封三。并采用荧光素酶实验验证miR-9与FOXP1的结合,结果提示,mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT组的荧光素酶活性低于转染mimic Con+FOXP1 3′UTR WT组,差异有统计学意义(P<0.0001),mimic Con+FOXP1 3′UTR Mut组与mimic miR-9+FOXP1 3′UTR Mut组的荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

2.2过表达miR-9对FOXP1表达的影响

过表达miR-9对FOXP1表达的影响,结果见图3,结果提示,过表达miR-9抑制FOXP1表达。在DLBCL细胞系OCI-Ly3细胞中使用mimic miR-9过表达miR-9,mimic miR-9组的FOXP1表达水平低于mimic Con组,差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

2.3 miR-9在DLBCL细胞系和B淋巴母细胞中的表达情况

结果提示,人DLBCL细胞系OCI-Ly3细胞的miR-9表达水平低于B淋巴母细胞,差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。

2.4过表达miR-9对OCI-Ly3细胞增殖的影响

在OCI-Ly3细胞中转染miR-9 mimic后进行细胞增殖检测,结果提示,在转染后12、24、48 h后,mimic miR-9组的细胞数目少于mimic Con组,差异有统计学意义(P<0.05)(图6)。

2.5过表达miR-9对OCI-Ly3细胞体外侵袭能力的影响

在OCI-Ly3细胞中转染miR-9 mimic后进行Transwell体外细胞侵袭实验,mimic Con组穿过Transwell的细胞数为(879±24)个,mimic miR-9组穿过Transwell的数目为(487±28)个。mimic miR-9组穿过Transwell的数目少于mimic Con组,差异有统计学意义(t=26.635,P<0.001)。

3讨论

FOXP1在许多生物过程中起着重要作用,包括T细胞和B细胞的发育和功能[12-15]。此外,FOXP1已被确认为是肝细胞癌、胰腺癌和各种类型的B细胞非霍奇金淋巴瘤的潜在致癌基因[16-18]。研究发现, DLBCL和粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤中,FOXP1的高表达与肿瘤预后不良相关联,并且促使其转变为侵袭性淋巴瘤[19-20]。长期以来,FOXP1被认为是DLBCL中推定的致癌基因,其通过促进B细胞存活,抑制浆细胞分化,增强Wnt信号传导和抑制主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子表达等机制发挥致癌作用[21-23]。

miRNA在转录后水平介导mRNA降解从而调控基因表达。本研究通过Targetscan数据库分析发现,miR-9可以与FOXP1的3′UTR区结合。通过荧光素酶实验证实miR-9与FOXP1的结合。过表达miR-9则导致FOXP1的表达水平降低,进一步证实miR-9作为FOXP1的上游靶标分子,调控FOXP1的表达。而FOXP1已经在DLBCL中进行了广泛的研究,已知它可以调节B细胞的存活和侵袭性,高FOXP1水平的DLBCL预后更差。因此其上游靶标分子miR-9在DLBCL中可能发挥重要作用。RT-PCR结果显示,在DLBCL细胞系中miR-9的表达低于人淋巴母细胞IM9。鉴于miR-9与FOXP1的3′-UTR區的结合及其对FOXP1的调节作用,miR-9的异常表达可能是导致FOXP1在DLBCL中高表达的机制之一。在DLBCL细胞系OCI-Ly3中过表达miR-9,可以抑制OCL-Ly3细胞的增殖和侵袭能力。表明miR-9可以靶向FOXP1调节DLBCL细胞的增殖和侵袭能力。miR-9的表达失调可能是促进DLBCL发展的机制之一。

综上所述,miR-9通过靶向FOXP1在DLBCL中起关键作用。MiR-9表达失调可通过上调其下游靶标分子FOXP1表达促进DLBCL细胞增殖和转移。本研究有助于了解miR-9在DLBCL中的作用及机制,然而,miR-9是否也通其他分子靶标调节DLBCL发生发展过程,仍有待进一步的研究。

[参考文献]

[1]Ren W,Ye X,Su H,et al.Genetic landscape of hepatitis B virus-associated diffuse large B-cell lymphoma[J].Blood,2018,131(24):2670-2681.

[2]Twa DDW,Mottok A,Savage KJ,et al.The pathobiology of primary testicular diffuse large B-cell lymphoma:Implications for novel therapies[J].Blood Rev,2018,32(3):249-255.

[3]Jacobsen E,La Casce A.Update on the therapy of highly aggressive non-Hodgkin′s lymphoma[J].Expert Opin Biol Ther,2006,6(7):699-708.

[4]Shimono J,Miyoshi H,Kiyasu J,et al,Clinicopathological analysis of primary splenic diffuse large B-cell lymphoma[J].Br J Haematol,2017,178(5):719-727.

[5]Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.

[6]Jonas S,Izaurralde E.Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing[J].Nat Rev Genet,2015, 16(7):421-433.

[7]Krol J,Loedige I,Filipowicz W.The widespread regulation of microRNA biogenesis,function and decay[J].Nat Rev Genet,2010,11(9):597-610.

[8]Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer[J].Nat Rev Genet,2009,10(10):704-714.

[9]Jia L,Xi Q,Wang H,et al.miR-142-5p regulates tumor cell PD-L1 expression and enhances anti-tumor immunity[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,488(2):425-431.

[10]Xu S,Tao Z,Hai B,et al.miR-424(322) reverses chemoresistance via T-cell immune response activation by blocking the PD-L1 immune checkpoint[J].Nat Commun,2016,7:11 406.

[11]Khafaei M,Rezaie E,Mohammadi A,et al.miR-9:From function to therapeutic potential in cancer[J].J Cell Physiol,2019.

[12]Koon HB,Ippolito GC,Banham AH,et al.FOXP1:a potential therapeutic target in cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2007,11(7):955-965.

[13]Banham AH,Connors JM,Brown PJ,et al.Expression of the FOXP1 transcription factor is strongly associated with inferior survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Clin Cancer Res,2005,11(3):1065-72.

[14]Patzelt T,Keppler SJ,Gorka O,et al.Foxp1 controls mature B cell survival and the development of follicular and B-1 B cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2018,115(12):3120-3125.

[15]Konopacki C,Pritykin Y,Rubtsov Y,et al.Transcription factor Foxp1 regulates Foxp3 chromatin binding and coordinates regulatory T cell function[J].Nat Immunol,2019,20(2):232-242.

[16]He J,Yang Z,Wu Z,et al.Expression of FOXP1 and FOXO3a in extrahepatic cholangiocarcinoma and the implications in clinicopathological significance and prognosis[J].Onco Targets Ther,2019,12:2955-2965.

[17]De Silva P,Garaud S,Solinas C,et al.FOXP1 negatively regulates tumor infiltrating lymphocyte migration in human breast cancer[J].E Bio Med,2019,39:226-238.

[18]Mottok A,Jurinovic V,Farinha P,et al.FOXP1 expression is a prognostic biomarker in follicular lymphoma treated with rituximab and chemotherapy[J].Blood,2018,131(2):226-235.

[19]Dekker JD,Park D,Shaffer AL,et al.Subtype-specific addiction of the activated B-cell subset of diffuse large B-cell lymphoma to FOXP1[J].Proc Natl Acad Sci USA,2016,113(5):E577-E586.

[20]van Keimpema M,Grüneberg LJ,Schilder-Tol EJ,et al.The small FOXP1 isoform predominantly expressed in activated B cell-like diffuse large B-cell lymphoma and full-length FOXP1 exert similar oncogenic and transcriptional activity in human B cells[J].Haematologica,2017,102(3):573-583.

[21]van Keimpema M,Grüneberg LJ,Mokry M,et al.FOXP1 directly represses transcription of proapoptotic genes and cooperates with NF-kappaB to promote survival of human B cells[J].Blood,2014,124(23):3431-3440.

[22]Brown PJ,Wong KK,Felce SL,et al.FOXP1 suppresses immune response signatures and MHC class Ⅱ expression in activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphomas[J].Leukemia,2016,30(3):605-616.

[23]Visco C,Li Y,Xu-Monette ZY,et al.Comprehensive gene expression profiling and immunohistochemical studies support application of immunophenotypic algorithm for molecular subtype classification in diffuse large B-cell lymphoma:a report from the International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program Study[J].Leukemia,2012,26(9):2103-2113.

(收稿日期:2019-07-04  本文編辑:孟庆卿)

猜你喜欢
母细胞靶标淋巴
教你一套全身淋巴按摩操
临床护理路径在小儿神经母细胞瘤治疗中的价值分析
6件事护好脆弱的淋巴
这种恶性肿瘤,3岁以下是高发期
靶标评改,让习作评改有序更有效
注意,有种“胖”不能靠运动去减
淋巴水肿的预防与照顾——乳癌康复者的隐忧
新杀菌剂靶标和先导化合物的探索
靶标网络与中医药研究
基于单幅立方体图的摄像机内参数标定