沉默Notch-1基因影响人膀胱癌RT4细胞生物学行为的体外实验研究

郑克文，潘 悦，黄 航，陈洪德，卢湧湧，吴可明，邓哲宪，翁志梁，余志贤，陈 伟

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命健康。据统计，世界范围内，每年新发膀胱癌患者数逾30万，在人类常见肿瘤中位居前列[1]。非肌层浸润性膀胱癌的治疗主要以手术联合术后膀胱灌注化疗为主。由于膀胱癌发病率高且术后复发率高，因此，研究膀胱癌发生发展相关的基因并寻找潜在的治疗靶点迫在眉睫。Notch-1广泛存在于各种细胞生物学行为过程中，参与多种细胞的增殖分化。研究显示，膀胱癌细胞中Notch1的表达量与其恶性程度呈正比[2-3]，抑制Notch-1的表达可以抑制膀胱癌细胞的增殖[4]。但Notch-1基因对于膀胱癌细胞的具体作用机制目前尚不清楚。因此，本文以人膀胱癌RT4细胞为研究对象，通过沉默Notch-1，观察其对RT4细胞增殖、侵袭、凋亡及上皮间质转化等生物学行为的影响，为临床治疗膀胱癌提供潜在靶点及相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人膀胱癌RT4细胞（中国科学院上海细胞库）；TEMED、丙烯酰胺（Amreso公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、磷酸酶抑制剂（上海碧云天公司）；PLVX-shRNA2载体（美国Addgene公司）；Trizol试剂，限制性内 切 酶EXORI、BamHI（美 国Thermo Fisher公司）；逆转录试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒（大连Takara公司）；兔单抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2（美国CST公司）；兔多抗Bad、兔单抗Bid（英国Abcam公司）；Transwell小室（美国BD公司）；细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒（南京凯基生物有限公司）。

1.2 细胞的复苏、培养 将人膀胱癌RT4细胞从-80℃冰箱取出后，按照“慢冻速溶”原则进行复苏，将细胞置于事先升温至37 ℃ 的水浴锅中使其融化，融化时间不超过1 min，然后将细胞分别培养于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（100 U/mL青霉素和0.1 mg/L的链霉素），并置于37℃，5% CO2恒温培养箱中进行培养。

1.3 质粒的构建及转染 本试验所用干扰序列于吉玛生物合成，序列如下：Notch1-shRNA上游序列：GATCCCCAACATCCAGGACAACATTTCAA GAGAATG TTGTCCTGGATGTTGGTTTTTTCT CGAGG，下 游 序 列：AATTCCTCGAGAAAA AACCAACATCCAGGACAACATTCTCTTG AAATGTTGTCCTGGATGTT GGG；shRNANc上 游 序 列：GATCCTTCTCCGAACGTGTC ACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTCGGA GAATTTTTTCTCGAGG，下游序列：AATTCCTC GAGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCT CTTG AAACGTGACACGTCGGAGAAG。序列退火成双链后，连接克隆到经EXORI、BamHI酶切的PLVX-shRNA2载体上。然后转化到感受态的大肠杆菌DH5α后，挑单克隆提取质粒并行测序分析，验证得到正确克隆的质粒。取对数生长期细胞于24孔板中，调整细胞浓度，使每个孔中的细胞数约为4×105个，在细胞融合度为70%～80%时进行转染。按照Lipofectamine 2000转染说明书对RT4细胞进行转染操作，转染8 h后更换含有氨苄青霉素（30 μg/mL）的培养基，继续于含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养，48 h后取出培养板，收集细胞进行后续实验，并用RT-PCR法分别检测T24细胞中Notch-1的表达。实验共分为2组，分别为Notch-1阴性对照组（shRNA NC），Notch-1干扰组（Notch-1 shRNA）。

1.4 MTT检测细胞增殖变化 取对数生长期细胞，调整细胞密度到5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液，置于5% CO2，37℃的恒温培养箱中培养过夜，然后向每孔中加入10 μL的MTT检测液，37 ℃培养4 h，吸弃培养基，加入150 μL的DMSO震荡10 min，然后将96孔板置于酶标仪中，于568 nm波长处测定各孔的吸光度。

1.5 Transwell法检测细胞侵袭能力变化 将转染成功后继续培养48 h的各组细胞分别用0.25%的胰蛋白酶进行消化收集，1000 r/min离心5 min，弃上清，用预冷的PBS清洗2次，然后在无血清培养基中对细胞进行重悬，采用细胞计数板进行计数，然后在24孔板中加入含有10% FBS的培养基，在Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μL终浓度为1 mg/mL的Matrigel，待Matrigel凝固后在Transwell上室分别加入200 μL的细胞悬液，5% CO2，37 ℃培养箱中培养24 h，然后取出Transwell，用PBS小心清洗小室，用10%甲醇溶液对细胞进行固定30 min，然后切下膜，滴入5%结晶紫染液，室温静置20 min后，显微镜下进行观察拍照。

1.6 流式细胞术检查细胞凋亡的变化 取转染继续培养48 h后的各组细胞，用0.25%胰酶消化，充分吹打混匀细胞悬液并收集至流式专用管中；取约105个重悬细胞，1200×g，4℃离心5 min，弃上清；加入1 mL预冷PBS进行重悬，1200×g，4 ℃离心5 min，弃上清，重复两次；按照AnnexinVAPC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒说明书进行检测，将细胞重悬于50 µL binding buffer，加入5 µL 7-AAD，轻轻混匀，4 ℃，避光孵育15 min；再加入450 µL binding buffer，混匀，加入1 μL Annexin V-APC混匀，室温下避光反应15 min，然后进行流式细胞仪上机检测。

1.7 RT-PCR检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Bcl-2、Bad、Bid mRNA表达情况 转染后，继续培养48 h，采用Trizol法提取各组细胞的总RNA，然后根据逆转录试剂盒说明书反转录成相应的cDNA。利用Real-time PCR检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid mRNA表达水平（引物序列见表1），PCR反应程序：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s，40个循环；65 ℃，5 min；95 ℃，50 s。以GAPDH作为内参，结果采用2-△△Ct法进行分析。

表1 引物序列表

1.8 Western blot检 测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid蛋白表达情况 转染后继续培养细胞48 h，然后收集并提取各组细胞的蛋白，采用BCA蛋白浓度检测试剂盒对所提取的蛋白进行浓度测定。然后取20 μg蛋白与4 μL 2×SDS上样缓冲液混合均匀，100 ℃变性10 min，上样，电泳，转膜后，用5%脱脂奶粉制成的封闭液进行封闭2 h，加入稀释后的 一 抗（Bcl-2：1∶1000；Bad：1∶500；Bid：1∶1000；Vimentin：1∶1000；E-cadherin：1∶500；N-cadherin：1∶1000；GAPDH：1∶1000），4 ℃孵育过夜，PBS洗膜后，加入HRP标记的二抗羊抗兔IgG（1∶50000），室温孵育1 h，然后用ECL化学发光检测，以目的蛋白光密度值／内参蛋白光密度值作为目的蛋白的光密度值，重复3次独立试验。

1.9 统计学分析 采用统计学软件SPSS 25.0进行数据分析，实验数据采用±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Notch-1 shRNA载体构建 如图1所示，构建的Notch-1 shRNA载体经测序分析表明插入的序列及位点正确，目的基因Notch-1的干扰载体质粒构建成功。

图1 Notch-1 shRNA载体质粒测序鉴定

2.2 两组细胞Notch-1的表达变化 为了研究Notch-1在人膀胱癌RT4细胞中的作用，我们采用质粒转染的方法抑制了RT4细胞中Notch-1的表达，然后采用RT-PCR检测两组细胞中Notch-1的表达。结果如图2所示，与RT4+shRNA NC组相比，RT4+Notch-1 shRNA组的Notch-1 mRNA表达量明显下降（t=10.004，P＜0.001）。

2.3 沉默Notch-1对膀胱癌RT4细胞增殖率的影响 结果如图3所示，与RT4+shRNA NC组相比，RT4+ Notch-1 shRNA组细胞增殖率明显降低（t=4.629，P=0.010）

图2 两组细胞Notch-1的表达水平变化

图3 两组细胞增殖率变化

2.4 沉默Notch-1对人膀胱癌RT4细胞的侵袭能力的影响 如图4所示，与阴性对照组（RT4+shRNA NC）相 比，Notch-1干 扰 组（RT4+Notch-1 shRNA）的迁移细胞数目明显减少（t=8.193，P=0.001）。

2.5 沉默Notch-1促进膀胱癌RT4细胞的凋亡 为了研究沉默Notch-1对人膀胱癌细胞凋亡的改变，我们采用流式细胞术对人膀胱癌RT4细胞进行了检测。结果如图5所示，与RT4+shRNA NC组相比，RT4+Notch-1 shRNA组的细胞凋亡率显著上升（t= -18.441，P＜0.001）。

2.6 沉默Notch-1对膀胱癌RT4细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid mRNA表达的影响 如图6所示，与RT4+shRNA NC组比 较，RT4+Notch-1 shRNA组 中E-cadherin（t=-13.457，P＜0.001）、Bad（t= -12.521，P＜0.001）、Bid（t= -9.231，P＜0.001）的mRNA表达量显著升 高，N-cadherin（t=6.505，P＜0.001）、Vimentin（t=9.135，P＜0.001）、Bcl-2（t=10.651，P＜0.001）mRNA表达量显著降低。

2.7 沉默Notch-1对膀胱癌RT4细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid蛋 白 的影响 我们对人膀胱癌RT4细胞的凋亡及侵袭迁移相关蛋白表达水平进行了检测，结果如图7显示，与阴性对照组相比，干扰组E-cadherin（t=-5.610，P=0.005）、Bad（t= -6.983，P=0.002）、Bid（t= -8.871，P=0.001）蛋白表达量显著升高，N-cadherin（t=10.132，P=0.001）、Vimentin（t=5.630，P=0.005）、Bcl-2（t=6.973，P=0.002）蛋白表达量显著降低。

图4 两组迁移细胞数量变化（×200）

图5 两组细胞凋亡率的变化

图6 两组细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid mRNA表达水平变化

图7 两组细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Bcl-2、Bad、Bid蛋白表达量变化

3 讨论

Notch信号通路大量存在于哺乳动物的体内，参与着体内众多的生命活动调节：维持细胞的分化、增殖和凋亡的动态平衡[5-6]。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体及细胞内效应器分子所组成，Notch受体包括4种受体，分别为Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4、Notch配体 包 括JAG1、JAG2、DLL1、DLL3和DLL4。Notch信号通路的异常可以诱导多种肿瘤的发生，其中，Notch-1的异常表达在肿瘤组织中最常被发现。Notch-1可以通过影响相邻细胞之间的信息传递来维持干细胞的特性。Notch-1还可以通过影响细胞的增殖、分化和凋亡来参与各种类型肿瘤的发生发展[7-8]。李伟等[9]研究发现，Notch-1能够促进乳头状癌细胞增殖、侵袭和转移。郝俊龙等[10]发现，抑制Notch-1的表达能够抑制骨肉瘤细胞的生长。Shi等[3]研究发现，在膀胱癌中，Notch-1的表达量随着膀胱癌的病理分级升高而逐渐增加，肿瘤的生长与凋亡密切相关。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中起着关键作用，Bcl-2基因是一种原癌基因，能够改变线粒体外膜的通透性，抑制细胞色素C释放到细胞质，从而阻止Caspase的活化级联，进而抑制细胞凋亡[11]。当Bcl-2呈高表达时，则抑制凋亡的发生；当Bcl-2呈低表达时，则促进凋亡[11]。Bid蛋白是Bcl-2家族中唯一含有1个BH-3结构域的重要的前凋亡分子，Bid 是促凋亡蛋白。在静息状态下，Bid以非激活状态分布在胞浆中，在细胞发生凋亡的过程中，全长的Bid通过多种蛋白酶被切割形成tBid，tBid转位到线粒体发挥凋亡功能[12]。Bad是Bcl-2相关死亡启动子，也是参与细胞凋亡的重要调控蛋白[12]。在本研究中，Notch-1抑制组细胞的增殖率和迁移数量显著降低，表明抑制Notch-1能抑制人膀胱癌RT4细胞增殖和迁移活动。Notch-1 shRNA组中凋亡相关蛋白Bad、Bid的表达量显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量显著降低，提示抑制Notch-1可以促进膀胱癌细胞的凋亡，这与以上Notch-1抑制细胞凋亡的结论相符。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指上皮细胞在某些因素的刺激下，失去极性和细胞间的紧密连接，从而获得浸润性和游走性迁移的能力。生理情况下，上皮细胞发生EMT转化可以修复受伤的正常组织。在肿瘤的发生发展过程中，EMT发挥着重要的作用。转移是肿瘤死亡的主要原因，EMT是转移级联反应中的一个起始和重要事件，在转移级联反应中上皮癌细胞失去极性和细胞接触，细胞间相互作用及黏附力减弱，癌细胞的迁移能力增强，伴随着E- cadherin等蛋白的表达下降，E- cadherin表达的降低目前已被认为是EMT最显著的特征，可使癌细胞获得易于侵袭的特性，Vimentin、N-cadherin等蛋白的表达升高，使得癌细胞获得促进迁移和侵袭的间充质特征[13]。研究发现，Notch-1可以通过介导各种EMT相关基因的表达从而诱导EMT的发生[14-15]。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白是EMT相关蛋白。E-cadherin广泛分布于胞膜和胞浆中，可维持上皮细胞间的紧密连接，对维持细胞的形态稳定具有重要的作用[16]，N-cadherin则主要是介导神经组织及成纤维细胞之间的黏附，Vimentin广泛分布于细胞间质之间。Kang等[17]研究发现，抑制Notch-1基因可以通过促进E-cadherin的表达、抑制Vimentin的表达，从而减轻肺癌细胞的EMT[18]。研究发现Notch还可以通过促进N-cadherin的表达从而促进癌细胞发生EMT。因此，为了进一步研究Notch-1 shRNA是否通过抑制膀胱癌细胞EMT从而发挥其作用，我们分别采用RT-PCR和Western blot对EMT相关蛋白进行了检测。在本实验中，E-cadherin表达量显著升高，N-cadherin、Vimentin表达量显著降低。而E-cadherin与肿瘤的转移、侵袭关系密切，且其表达量与癌症患者的生存率呈正比[19-20]，N-cadherin和Vimentin蛋白则具有促进细胞黏附和信号传导的作用[21]，提示抑制Notch-1的活性可以抑制EMT相关蛋白的表达，从而抑制膀胱癌细胞的侵袭转移。

综上所述，抑制Notch-1的表达能够抑制人膀胱癌细胞的侵袭迁移，促进细胞凋亡，其机制可能与诱导Bad、Bid、E-cadherin，抑制Bcl-2、N-cadherin、Vimentin的表达有关。