黄柏碱改善脓毒症大鼠急性肾损伤的作用及机制研究

姜盈盈，林 岳

黄柏最早记载于《神农本草经》，被列为上品，主要来源于芸香科植物黄皮树（Phellodendron chinense Schneid）的干燥树皮，具有清热燥湿、解毒疗疮等功效。研究发现，黄柏的药理活性主要表现为抗炎、抗菌、抗病毒及抗氧化等[8]。近来发现，由黄柏、黄连等组方而成的黄连解毒汤在脓毒症的治疗中疗效显著，同时发现黄柏碱是其中重要的入血成分[9]。黄柏碱为黄柏中的关键生物碱成分，其具有良好的降血压和抗肾炎等活性[10-11]。黄柏碱参与了脓毒症及肾炎的治疗过程，而其对于脓毒症并发急性肾损伤（AKI）是否存在潜在作用尚不清楚。因此本课题拟采用脓毒症大鼠模型，通过治疗考察黄柏碱的药效活性、分析其潜在药理机制，为脓毒症并发AKI的治疗提供新的治疗策略，为黄柏及其相应组方的临床运用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级SD大鼠，雄性，8周龄，体重180～220 g，动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005），购自上海斯莱克实验动物有限公司。大鼠饲养于层流架中，自由进食饮水，造模前12 h昼夜交替饲养3 d，保持恒温条件。

1.2 主要试剂及仪器 黄柏碱（HPLC≥98%，H-100718-03），成都瑞芬思生物科技有限公司；Cr、BUN试剂盒，南京建成生物工程研究所；NGAL、KIM-1、IL-6、IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；HE染色试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；全蛋白提取试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司；TLR4及NLRP3抗体，美国Abcam公司；ECL显影试剂盒，美国GE公司；SDS-PAGE试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。垂直电泳仪、半干转膜仪，上海天能科技有限公司；凝胶图像分析系统，美国GE公司；组织脱水机、包埋机，日本樱花精机株式会；AX70显微系统，日本Olympus公司；MK3型酶标仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 模型建立 取健康大鼠，采用盲肠结扎穿刺术（CLP）方法[12]制备脓毒症大鼠模型。首先采用戊巴比妥钠进行麻醉，在无菌工作台中沿腹正中线切开，暴露大鼠盲肠。4-0丝线环形结扎盲肠末端1.5 cm处，18号针头在游离端穿透2次，挤出少许粪便，还纳肠管并逐层缝合腹壁切口。假手术大鼠仅探查盲肠，不结扎或穿孔。

1.4 分组与给药 造模结束，取脓毒症大鼠随机分为4组：模型组、黄柏碱低剂量组（100 mg/kg）、黄柏碱高剂量组（200 mg/kg）及氨苄青霉素钠组（150 mg/kg），另取假手术大鼠设为假手术组，每组10只。给药组尾静脉注射相应剂量药物，假手术组及模型组大鼠则给予0.5 mL生理盐水。术后24 h眼眶取血，离心收集血清，随后脱颈椎处死大鼠，取出肾脏，部分组织浸泡于10%甲醛溶液，部分匀浆后取上清液，剩余肾脏组织置冻存管，并放入-80℃冰箱保存。

1.5 血清生化指标测定 根据试剂盒说明书进行操作，检测大鼠血清中肾损伤指标（Cr、BUN、NGAL及KIM-1）以及炎性因子（IL-6、IL-1β及TNF-α）的含量。

1.6 肾脏病理变化检测 从10%甲醛溶液中取出肾组织，经石蜡包埋、切片、脱蜡、脱二甲苯、核染、分化与漂洗、染色、脱水、透明和封片，在光镜下对肾组织病理改变进行观察。根据管状上皮增生、刷状缘消失、空泡变性及上皮脱落等镜检指标进行观察。

1.7 免疫印迹法检测肾组织中TLR4及NLRP3蛋白表达 取肾组织全蛋白抽提液，根据BCA试剂盒说明书对上清液中蛋白含量进行测定。经上样缓冲液孵育后，各组取等量蛋白进行凝胶电泳，半干转膜至PVDF膜。经BSA封闭后加一抗TLR4（1:1000）及NLRP3（1:1000）在4℃进行杂交孵育。次日在室温中加二抗进行孵育，通过滴加ECL显影液进行显影成像，根据Image J软件进行灰度值半定量分析。

1.8 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平比较 与假手术组大鼠比较，模型大鼠血清中炎症因子（TNF-α、IL-6及IL-1β）水平显著提升（P＜0.01）。与模型大鼠比较，在TNF-α含量检测后发现，黄柏碱低、高剂量与氨苄青霉素钠可明显抑制TNF-α的分泌，其中以黄柏碱高剂量与氨苄青霉素钠的作用显著（P＜0.01）；在IL-6含量检测后发现，黄柏碱高剂量与氨苄青霉素钠可明显抑制IL-6的分泌，其中以黄柏碱高剂量的作用显著（P＜0.01）；在IL-1β含量检测后发现，黄柏碱低、高剂量与氨苄青霉素钠均可显著抑制IL-1β的分泌（P＜0.01）。结果见表1。

2.2 各组大鼠血清Cr及BUN含量比较 与假手术组大鼠比较，模型大鼠血清中肾功能指标（Cr及BUN）水平显著提升（P＜0.01）。与模型大鼠比较，在Cr含量检测后发现，黄柏碱低、高剂量与氨苄青霉素钠可明显降低Cr的含量，其中以黄柏碱高剂量与氨苄青霉素钠的作用显著（P＜0.01）；在BUN含量检测后发现，黄柏碱低、高剂量与氨苄青霉素钠可明显降低BUN的含量，其中以黄柏碱高剂量与氨苄青霉素钠的作用显著（P＜0.01）。结果见表2。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β含量的比较

表2 各组大鼠血清Cr及BUN含量的比较

2.3 各组大鼠血清NGAL及KIM-1含量比较 与假手术组大鼠比较，模型大鼠血清中肾损伤标志物（NGAL及KIM-1）水平显著提升（P＜0.01）。与模型大鼠比较，在NGAL含量检测后发现，黄柏碱低、高剂量与氨苄青霉素钠可明显降低NGAL的含量，其中以黄柏碱高剂量的作用显著（P＜0.01）；在KIM-1含量检测后发现，黄柏碱低、高剂量与氨苄青霉素钠可明显降低KIM-1的含量，其中以黄柏碱高剂量与氨苄青霉素钠的作用显著（P＜0.01）。结果见表3。

表3 各组大鼠血清NGAL及KIM-1含量的比较

2.4 各组大鼠肾脏组织病理结果 通过组织病理检测发现，模型组大鼠肾组织间隙出现明显水肿，可见弥漫嗜中性粒细胞浸润，肾小球严重皱缩，而肾小管官腔闭塞，部分细胞肿胀、空泡变性，肾小管囊腔扩张等。再给予黄柏碱低、高剂量及氨苄青霉素钠治疗后，大鼠肾组织中可见肾小管灶状损害减轻，肾小管肿胀及空泡变性也均有改善，炎性细胞浸润及组织间隙水肿得到不同程度缓解，其中以黄柏碱高剂量及氨苄青霉素钠的改善较佳。结果见图1。

图1 各组大鼠肾组织HE染色

2.5 各组大鼠肾脏组织TLR4及NLRP3蛋白表达比较 与假手术组大鼠比较，模型大鼠肾组织中TLR4表达水平显著提升（P＜0.01）。与模型大鼠比较，在TLR4水平检测后发现，黄柏碱高剂量与氨苄青霉素钠均可显著降低组织中TLR4蛋白表达水平（P＜0.01）；在NLRP3水平检测后发现，黄柏碱低、高剂量与氨苄青霉素钠可明显降低NLRP3的含量，其中以黄柏碱高剂量与氨苄青霉素钠的作用显著（P＜0.01）。结果见表4、图2。

表4 各组大鼠肾脏组织TLR4及NLRP3表达水平的变化

图2 各组大鼠肾脏组织TLR4及NLRP3表达水平的变化

3 讨论

脓毒症是指因病原体入侵机体后导致的一系列持续性过度炎症及持续性免疫抑制反应，是机体器官衰竭的重要因素，可导致患者休克甚至死亡[1]。脓毒症是临床常见的全身性危重综合症，在重症监护病房 (intensive care unit，ICU)中其病死率高达35%[2]，严重威胁患者生命健康安全，给社会及患者家庭带来沉重负担[3-4]。研究发现，脓毒症患者中并发AKI的风险高达50%，且该类患者预后较差，死亡率较高[5-6]。临床常通过补液、静脉滴注抗生素及利尿剂等策略实施脓毒症AKI的治疗，但脓毒症AKI患者的高死亡率并未得到有效缓解[7]，因此探索新的脓毒症AKI治疗药物，对缓解肾脏损伤、挽救患者生命与健康具有重大意义。

AKI是ICU期间常见的并发症，由多种致病因素（脓毒症、缺血缺氧及药毒性）诱发而导致短期内肾功能快速下降。AKI临床表现主要包括肾小球滤过率降低、水电解质紊乱、肌酐升高及尿量减少等。AKI通常伴有严重并发症，通过干扰其他生理系统，导致体内多脏器衰竭[13]，严重并发症可使患者病死率提升至30%[14]。脓毒症是AKI的主要因素[15]，中医认为脓毒症属“伤寒”“热病”范畴，通常将其病机归为“毒瘀互结”，而其所致AKI则为机体正气亏虚，外感温热毒邪引发三焦失司，继而累及脏腑[16]，因此常采用清热解毒法进行治疗[17-19]。本课题通过大鼠CLP，使得含大量菌群的肠内容物污染腹腔，诱发弥漫性腹膜炎，导致广泛的全身性、自我破坏性炎症反应。该脓毒血症模型可有效模拟临床脓毒症患者的血液动力学、炎症反应及代谢变化[20]。此外，由于氨苄青霉素钠作为抗菌药，在临床脓毒血症病情控制中发挥着重要作用[21]，也是脓毒血症体内实验中常用的阳性对照药，可通过控制细菌感染从而缓解脓毒血症并发症[22]，故将其作为阳性对照药。基于黄柏为清热燥湿、解毒疗疮的传统中药，本实验拟围绕其核心成分黄柏碱展开研究，考察其治疗脓毒症AKI的作用及相关机制。

研究认为，脓毒血症通过调控血流动力学、内毒素、炎性因子、细胞凋亡及免疫抑制等因素直接参与AKI的形成[23]，而炎症介质的过度释放与脓毒症AKI的发生、发展存在直接联系。TNF-α、IL-6及IL-1β作为标志性炎症介质，在脓毒症血清中明显增加[24]。研究表明，TNF-α、IL-6及IL-1β可通过诱导肾小球中性粒细胞浸润及单核细胞转移，最终导致肾脏受损[25]。同时有证据发现，降低上述炎症因子的水平可有效缓解脓毒症AKI[26]。实验结果发现，脓毒症AKI大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平显著上升，肾脏病变严重；通过黄柏碱干预后可有效降低大鼠血清中该类炎症因子含量，且不同程度地缓解肾脏病变。由此提示，黄柏碱可能通过下调体内炎症水平，继而达到减轻脓毒症AKI的作用。

NGAL和KIM-1是近年来发现的与脓毒症AKI诊断紧密关联的生物标志物。生理条件下，NGAL主要在中性粒细胞及肾小管上皮细胞中低水平表达[27]，当机体处于病理改变时其表达迅速增加。研究发现，缺血或肾毒性模型小鼠体内NGAL表达增加[28]，同时亦当作幼儿行体外循环后发生AKI的判断依据[29]。因此NGAL可被看作为早期的、灵敏的AKI标记物。KIM-1主要在肾脏近曲小管上皮细胞低表达，当处于AKI时，其表达量显著增加。KIM-1可促进上皮细胞黏附，因此AKI改善后期表达量也逐步降低直至损伤修复[30-31]。由于KIM-1具有高度的敏感性与特异性，因此也是良好的AKI诊断指标。同时在科研及临床中，Cr与BUN通常是评价肾功能的金指标，Cr可较好的反映早期肾损伤程度，而BUN可间接反映肾脏的排泄能力[32]。研究结果表明，黄柏碱可有效降低脓毒症AKI大鼠体内肾损伤标志物（NGAL和KIM-1）水平，改善肾功能指标（Cr与BUN）分泌。由此提示，黄柏碱可通过减轻肾损伤、改善肾功能，继而在脓毒症AKI进程中达到保护肾脏的作用。TLR4与NLRP3作为固有免疫系统的识别受体，广泛分布于免疫细胞及体内器官中。当病原微生物感染机体后，通过分泌内毒素激活TLR4信号通路，继而激活下游一系列信号通路（如NF-κB通路）[33]，促进TNF-α、IL-6及IL-1β合成与分泌，加剧炎症反应[34]。TLR4/NF-κB不仅参与炎症的调节，同时也着重参与NLRP3炎症复合体的激活[35]。已有研究表明，NLRP3炎症复合体在AKI的病理进程中占据关键角色，可同时促进血清Cr升高，增加中性粒细胞浸润，同时将IL-1β前体转化为成熟的IL-1β并释放到细胞外，促进炎症反应[36-37]。其中NLRP3蛋白的表达则可视为炎症复合体激活的限速靶点[38]。研究结果显示，脓毒症AKI大鼠肾组织中TLR4与NLRP3表达水平显著增加，而黄柏碱干预后可明显抑制TLR4与NLRP3的表达。由此提示，黄柏碱可能通过调控TLR4/NLRP3信号通路，继而达到改善脓毒症AKI的作用。

综上所述，黄柏碱可有效减少脓毒症AKI大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β的分泌水平，从而缓解肾脏损伤的病理进程。由于黄柏碱的肾脏保护作用，使得大鼠血清中肾损伤标志物（NGAL和KIM-1）的表达及肾功能指标（Cr与BUN）的分泌明显减少，而上述作用可能与黄柏碱下调TLR4/NLRP3信号传导有关。通过本研究，明确验证了黄柏碱改善脓毒症AKI的作用，深刻阐释了其保护肾脏的机制，为脓毒症AKI的干预提供新的方法与策略，为黄柏的研究及运用提供新思路。