HPLC波长切换法同时测定清骨解毒生血丸中4种指标成分

刘海燕，魏佩尧，童蒙蒙

（1.河南省周口市食品药品检验所，河南 周口 466000； 2.河南省周口市川汇区小桥社区卫生服务中心，河南 周口 466000）

清骨解毒生血丸是周口市中医院自制的一种纯中药制剂，本方由水牛角、熟地黄、生地黄、玄参、牡丹皮、地骨皮、茜草、山豆根、桑叶、蒲公英、甘草、白茅根组成，具有清热解毒、凉血止血、滋阴的作用，适用于热毒炽盛所致的骨蒸疼痛、发热、头晕乏力、眩晕耳鸣、烦躁不安、皮下伴出血、贫血等症。清骨解毒生血丸质量控制执行标准为医院内部制剂标准，仅规定了药品的性状、个别成分的薄层色谱鉴别和常规检查，没有主要成分含量的控制，本实验参照相关文献[1-5]，采用高效液相色谱波长切换法同时测定清骨解毒生血丸中梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚的含量，测定结果准确、可靠，为全面评价该药品的内在质量和临床合理用药提供科学依据和技术参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 高效液相色谱仪（美国沃特世科技有限公司）；2998 PDA检测器（美国沃特世科技有限公司）；岛津SHIMADZU AP135W十万分之一电子分析天平（岛津企业管理（中国）有限公司）；KQ-500超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；明澈-D 24UV（德国默克密理博）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒仪器有限公司）；DZKW-D-4电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）。

1.2 试药

梓醇对照品（批号：110808-201210，含量为98.1 %）、芍药苷对照品（批号：110736-201741，含量为95.7 %）、毛蕊花糖苷对照品（批号：111530-201512，含量为96.7 %）、丹皮酚对照品（批号：110708-201407，含量为99.9 %），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯（默克股份两合公司）；水为超纯水；磷酸为分析纯；清骨解毒生血丸（周口市中医院，批号：20180709，20180715，20180721）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A相乙腈，B相0.1 %磷酸溶液，梯度洗脱（0～12 min，乙腈比例为1 %～14 %；12～35 min，乙腈比例由14 %～20 %；35～40 min，乙腈比例由20 %～45 %；45～52 min，乙腈比例为45 %）；流速：1.0 ml/min；梓醇的检测波长为210 nm（0～15 min），芍药苷的检测波长为230 nm（15～28 min），毛蕊花糖苷的检测波长为334 nm（28～40 min），丹皮酚的检测波长为274 nm（40～52 min）；进样量：10 μl；柱温：30 ℃ 。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取梓醇 、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚对照品适量，分别加50 %甲醇溶液制成质量浓度为0.2251，0.2014，0.07561和0.4281 mg/ml对照品储备液。分别精密吸取上述4种对照品储备液各1 ml，置于10 ml量瓶，加乙腈-0.1 %磷酸溶液（1:99）稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取样品2.0 g，置于100 ml具塞锥形瓶，精密加入甲醇溶液50 ml，密塞，称定重量，加热回流提取1.5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 ml，浓缩至近干，残渣用乙腈-0.1 %磷酸溶液（1:99）溶解，转移至10 ml量瓶，并用乙腈-0.1 %磷酸溶液（1:99）稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照处方比例和制备工艺制备不含生地黄和熟地黄的阴性样品和不含牡丹皮的阴性样品，再按照2.2.2项下方法分别制备阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

取2.2项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μl，按2.1项下色谱条件 测定，记录色谱图，见图1。结果表明，供试品溶液色谱图中在与混合对照品溶液色谱图上相应的位置有相同的色谱峰，且阴性样品溶液无干扰。

图1 专属性试验HPLC图谱

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2.1项下的混合对照品溶液2，5，10，15，20，25和30 μl，分别注入高效液相色谱仪，按照2.1项下的色谱条件测定，记录各自的峰面积。分别以梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚的进样量X（μg）为横坐标、以各自的峰面积A为纵坐标进行线性回归，得到梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚回归方程分别为：A1=188.91X1+143.77（r=0.9996），A2=1428.2X2+10.771（r=0.9998），A3=1564.9X3+3.9124（r=0.9999）和A4=4995.3X4+5.638（r=0.9999）。结果表明，梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚的进样量分别在0.04502～0.6753 μg，0.04028～0.6042 μg，0.01512～0.2268 μg和0.08561～1.2842 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下的色谱条件连续进样6次，记录峰面积。计算得到梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.87 %，0.59 %，0.91 %和0.45 %（n=6）。结果表明，仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，分别于0，2，5，7，12和24 h，按照2.1项下的色谱条件测定，记录峰面积。结果梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.64 %，0.48 %，0.81 % 和0.64 %，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.7 重复性试验

取清骨解毒生血丸（批号：20180709）按照供试品溶液制备方法平行制备5份样品溶液，分别依次测定，记录峰面积并计算梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚的含量。结果4种成分的平均含量分别为1.0265，1.0181，0.4287和2.4806 mg/g，RSD分别为1.48 %，1.29 %，1.85 %和1.08 %（n=5）。结果表明，该方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的清骨解毒生血丸（批号：20180709）6份，每份约1 g，分别精密加入新配制的梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚对照品混合溶液（质量浓度依次为172.5，57.68，18.25和83.26 μg/ml）3 ml，按照2.2.2项下方法制备加样供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各活性成分回收率。结果，梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚平均加样回收率分别为97.89 %（RSD=0.92 %），98.51 %（RSD=0.86 %），97.87 %（RSD=1.13 %）和98.88 %（RSD=0.63 %），结果见表1。

表1 梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚加样回收率测定结果

2.9 样品的含量测定

取3批清骨解毒生血丸，按照2.2.2项下方法制备样品溶液，再按照2.1项下色谱条件进行测定，记录各自峰面积，根据2.4项下对应对照品回归方程计算各指标成分的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 在试验过程中总共选择了4种流动相系统：乙腈-0.1 %醋酸溶液、甲醇-水、乙腈-0.1 %磷酸溶液和乙腈-水；提取方法用了蒸馏法和超声波振荡法。通过正交试验设计表明，乙腈-0.1 %磷酸溶液流动相系统梯度洗脱有助于各色谱峰的分离，色谱峰峰形良好，各峰的分离度也较好；蒸馏法样品提取更完全，结果更准确，满足实验要求。

表2 样品中梓醇、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚含量测定结果（n=3）

3.2 中药复方是多成分协同发挥治疗作用，很难用单一组分的含量来说明其质量。本试验选取方中4种主要指标成分作为质量控制指标，参考相关文献[6-8]，采用不同时间段变换不同波长[9-13]，在指标性成分各自的最大吸收波长下测定其含量，避免了干扰组分对待测物质测定的影响，测定结果精密度高、重复性好、结果准确可靠、操作简便快捷。