表皮松解性掌跖角化病二家系基因突变检测

郭韫懿 祝 英 张丹露 郭碧蓉 孙忠辉

表皮松解性掌跖角皮症(epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK)主要临床表现是手掌和足趾发生过度角化，是一种常染色体显性遗传病[1]。目前研究显示该病是由不同致病基因引起：KRT1、KRT9和KRTl6，因此该病具有遗传异质性。本课题组诊断两个表皮松解性掌跖角化症家系，进行了致病基因研究，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 临床资料 先证者1，男，58岁，工人。因双掌跖角化50余年，于2015年8月来我院就诊。先证者自4岁起无明显诱因双掌跖部出现对称性片状红斑，角化，形状不规则，受累皮肤粗糙增厚，一般无自觉症状，有时伴有瘙痒、疼痛。皮疹逐渐向周围扩展，至15岁时已累及双手整个掌侧及双足跖，部分皮疹成蜡黄色角化性斑块；指(趾)甲未见增厚、混浊。23岁后皮疹未再扩展。期间双掌、双足部皮疹反复发作，有一定季节性，冬重夏轻，伴有足部多汗(图1a、1b)。家族史：调查家族中4代人。先证者父母非近亲结婚，外祖父、母亲(均已亡)有此病史，先证者儿子正常。符合常染色体显性遗传模式。体格检查：一般情况良好，各系统检查未见明显异常。皮肤科检查：皮疹分布于双手掌、双足底部，主要表现为境界清楚的黄色角化斑块、丘疹，伴脱屑。

先证者2，男，37岁，工人。因双掌跖角化30余年，于2015年6月来我院就诊。先证者自5岁起无明显诱因双掌跖部出现对称性片状红斑，角化，形状不规则，受累皮肤粗糙增厚，通常无自觉症状，有时伴有瘙痒、疼痛。皮疹逐渐向周围扩展，至20岁时已累及双手整个掌侧和双足跖，部分皮疹成坚硬蜡黄色角化斑块；指(趾)甲未见变形。20岁后皮疹未再扩展。期间双掌，双足部皮疹反复发作，呈角化过度，脱落，再角化，交替进行，有一定季节性，冬重夏轻。(图1c、1d)。家族史：调查家族中3代人。先证者父母非近亲结婚，父亲发病(已亡)；目前家族中共有患者3人，其中男2例，女1例。先证者儿子、女儿发病，符合常染色体显性遗传模式。体格检查：一般情况良好，各系统检查未见明显异常。皮肤科检查：皮疹分布于双手掌、双足底部，主要表现为境界清楚的黄色角化斑块、有皲裂。

两例先证者病理相似：角化亢进，表皮增生，颗粒层增厚，棘层肥厚，真皮浅层血管周围稀疏淋巴组织细胞浸润。颗粒层及棘层未见裂隙及颗粒性空泡变性，未见表皮松解(图1e、1f)。

1.2 外周血DNA提取 获得知情并签署同意书后，抽取2家系患者及亲属外周血3mL。其中，家系2患者为先证者2和一子、一女。应用QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN公司，德国)提取基因组DNA，标化质量浓度至10mg/μ。另外，以同样的方法提取100名无亲缘关系的健康个体基因组DNA作为对照。

1.3 PCR扩增及DNA测序 通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查取KRT1、KRT9和KRT16基因核苷酸序列,Primer 3.0设计KRT1、KRT9和KRT16外显子特异性引物 (htttp://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)。PCR扩增后，所有PCR产物经纯化后直接在ABI PRISM® 3700测序仪上测序(Applied Biosystems)。测序结果与人类基因组KRT1、KRT9和KRT16基因核苷酸序列比较。使用Chromas 2.2软件进行解读，并用Geneious 11.1进行比对分析。

2 结果

PCR产物经测序发现：患者1家系先证者KRT1基因CDS第598处杂合T碱基成为C碱基，因此编码的苯丙氨酸变为亮氨酸。即：c.598T>C，p.F200L。经检索HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、LOVD(http://www.lovd.nl/3.0/home)数据库该突变是国内首次报道(图2a)。家系2先证者及子女 KRT9基因CDS第488处杂合T碱基成为A碱基，因此编码的精氨酸变为天冬酰胺。即：c.G488>A,p.R163Q。该突变为该病常见突变(图2b)。而两个家系的家系内正常对照及家系外100个无亲缘关系的正常人中均不存在此突变。

图11a、1b：先证者1临床表现；1c、1d：先证者2临床表现；1e、1f：先证者1组织病理可见角化亢进，表皮增生，颗粒层增厚，棘层肥厚，真皮浅层血管周围稀疏淋巴组织细胞浸润(HE，×40；×200)

2a、2b：家系1和家系2家系图；2c、2d：家系1、家系2患者测序结果

图2家系图和测序结果 (箭头所示为先证者，+表示DNA测序者)

3 讨论

掌跖角皮症(palmoplantar keratoderma，PPK)是一组掌跖角化疾病的统称，存在二十几种亚型。根据临床症状发生形态的不同，PPK可以分为3种类型：弥漫性、局灶性和点状性。由于是仅根据临床形态来分型，而每一型往往致病基因有多个，所以总的来说PPK是遗传异质性很强的一组疾病。EPPK是弥漫性掌跖角皮症的一个亚型，OMIM号为144200。根据国际人类中间丝数据库(Human Intermediate Filament Database，HIFD,http://www.interfil.org/)截止2014年11月22日的数据显示，目前明确的致病基因有KRT1、KRT9 和KRT16。我们虽将KRT16基因列入侯测基因，但既往仅报道过一例EPPK是KRT16突变引起，也仅是罕见的嵌合型[2]，目前的文献表明所有KRT16基因突变与先天性厚甲症[3]有关。因此EPPK主要致病基因是KRT1和KRT9。

EPPK属于常染色体显性遗传，多为婴儿期开始发病，轻者仅有掌跖皮肤粗糙，重者掌跖处出现表皮松解性斑块状、边缘清晰的角质增厚，呈黄色胼胝体样。有时角质增厚可蔓延至掌跖皮肤侧缘或手足背，可伴有指节垫、甲板增厚浑浊、指趾屈曲畸形等。病理：表皮高度角化过度，颗粒层及棘层增厚；可有表皮松解，即可见裂隙及颗粒性空泡变性。EPPK与非表皮松解性掌跖角皮症(NEPPK)本质是同一病，因临床改变是一样的，且都是KRT1、KRT9突变引起。NEPPK 又名“Thost” 型掌跖角皮症，早在1880年由Thost 发现并命名。2002年Kuster等[4]重新检测了Thost患者的后裔，结果组织病理还是显示有表皮松解。本研究致病突变检测，家系1先证者的KRT1基因突变p.F200L 2016年Gagliardi[5]已报道；而家系2的KRT9基因突变p.R163Q是目前国内外均已报道的热点突变。虽然两先证者组织病理都未见表皮松解现象，但结合临床症状和基因诊断结果，两家系患者都诊断为EPPK。

KRT9角蛋白局限性的表达于掌跖表皮中[6]，突变引起的疾病仅是EPPK 。KRT9基因虽然异质性不强，但存在突变热点区和热点突变。数据库显示KRT9基因突变热点区位于1A区前端的157-172个氨基酸位置。在总共25个突变中位于1A区域有20个，位于2B区仅5个。基因突变频率最高的是第163氨基酸突变，Liu[7]统计该位置约占所有报道病例的44%，而p.R163W约占29.33%,其次为p.R163Q约占10%。第163位氨基酸突变可能影响角蛋白中间丝组装，从而导致EPPK。本研究先证者2家系正是携带此突变，因而是明确的EPPK。

相较于KRT9角蛋白，KRT1角蛋白主要表达在全身表皮的棘层和颗粒层细胞,其突变可以引起众多表型。目前显示除了EPPK，表皮松解性角化过度型鱼鳞病(EHK)、先天性大疱性鱼鳞病样红皮病(BCIE)、周期性鱼鳞病伴表皮松解性角化过度(CIEH)、豪猪状鱼鳞病(IHCM)、弥漫性非表皮松解性掌跖角皮症(NEPPK)、条纹状掌跖角皮症(SPPK)、常染色体显性遗传脑白质营养不良(ADLD)和 Greither综合征(GS)也与其突变有关。HIFD数据库显示KRT1突变目前有47个，大多数(32个)是引起表型相对严重的BCIE,而表型相对较轻的PPK(包括EPPK,NEPPK)仅有8个，均为错义突变。引起BCIE的突变绝大多数位于角蛋白1A和2B区域。KRT1中1A和2B是编码体内角蛋白丝装配的重要区域，该区域改变会影响角蛋白丝的形成并影响其稳定性，进而影响角蛋白网状结构形成[8]。在8个引起PPK的突变中，影响的编码序列分别位于头、1A、1B和2B区域，未显示突变热点。PPK有遗传异质性，同样在KRT1基因也表现出了复杂的临床异质性。KRT1同一突变可在家系内引起不同表型，比如Nellen[9]描述一家系携带c.1016T>A，4岁先证者是严重的表皮松解EHK。患者不仅有EPPK和屈曲部位的疣状增厚，还有躯干部位过度角化和去除鳞屑后的糜烂。而患者家系其他患者仅有EPPK和皮肤摩擦后出现水疱。同样的，KRT1同一突变可在家系以外引起不同表型。比如国内学者报道的一例EPPK[10]与国外报道[11]的BCIE和CIEH的致病突变都是KRT1错义突变c.1436T>C。

然而，本研究先证者1的突变p.P200L目前文献显示仅一例为意大利报道[5]。Gagliardi报道采用外显子测序发现一家系中既有进行性神经性肌萎缩综合征(CMT)，又有PPK的患者4例，其他患者单独患有CMT或PPK各1例。作者认为这两个疾病是单独引起，致病突变分别是MPZ 基因的p.Ser44Phe 和KRTI基因p.P200L。p.P200L位于1A区域，经蛋白预测软件SIFT Pred、Polyphen 2和 Mutation Taster都认为是致病突变。由于其合并其它基因突变、表型复杂，p.P200L所致EPPK的病情是否发展、有无异质性，还需随访观察。我们报道的也是同一突变PPK家系，符合文献，但无其它合并基因突变疾病。由于KRT1基因突变存在上文所述的复杂的临床异质性，所以先证者1还是需要随访，以观察其病情发展。另外，本突变在中国人群是首例报道。