桂西地区109例乳腺癌患者TOP2A基因变异的临床病理意义分析

(右江民族医学院临床病理诊断与研究中心，广西 百色 533000)

乳腺癌是我国女性发病率首位的恶性肿瘤，死亡率较高，近年来我国乳腺癌的发病呈上升趋势并伴有低龄化的特征。随着精准医学的发展，癌症的诊疗已经进入分子诊断与个体化治疗时代。TOP2A 基因定位于17号染色体 17q11.2-22区，编码人类拓扑异构酶 Ⅱα (topoismerase Ⅱ alpha，TOP2A)，在DNA复制过程中发挥重要作用。TOP2A基因变异包括基因扩增和基因缺失。蒽环类药物是乳腺癌常用化疗药物之一，TOP2A 基因扩增的乳腺癌患者对含蒽环类化疗方案更敏感。在HER2和TOP2A基因共扩增的患者中蒽环类药物疗效显著[1]。

为了明确桂西地区妇女乳腺癌TOP2A变异与相关临床病理特征的关系，探讨TOP2A基因作为乳腺癌预后判断指标的临床应用价值，本文对桂西地区109例乳腺癌病例开展TOP2A基因变异及其临床病理特征分析，为临床开展乳腺癌个体化诊疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集右江民族医学院附属医院腺体外科2017年1月—2019年8月收治的109例乳腺浸润性导管癌病例。患者年龄25～70岁，中位年龄48.4岁，术前均未进行过放化疗或分子靶向治疗。标本均于离体后30 min内经10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切片及HE染色，由2名病理医生(职称均为主治医师及以上)阅片确诊为浸润性乳腺癌。

1.2 试剂与探针 免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)检测ER、PR、Ki-67和 HER-2/neu使用福州迈新生物科技有限公司试剂(ER克隆号：SP1，批号1903200501b；PR克隆号:SP2，1907030502e；Ki-67克隆号：MX006，批号1905080672e；HER-2/neu克隆号 EP3，批号19042590c)。荧光原位杂交检测(Fluorescence in situ hybridization ，FISH)使用广州安必平医药科技股份有限公司HER2/neu(17q12)/TOP2A(17q21)/CSP17多色检测试剂盒(批号201812002)。

1.3 方法

1.3.1 FISH法 玻片常规脱蜡复水，纯水100℃水浴20 min，蛋白酶消化10 min，85℃变性37℃杂交过夜，DAPI染核，封片，荧光显微镜下观察结果。

1.3.2 IHC法 取玻片常规脱蜡复水，抗原修复，一抗孵育4℃过夜，二抗孵育室温30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明，封片，显微镜下观察结果(注：染色过程同时设立阴性和阳性对照)。

1.4 判读标准 TOP2A判读标准采用试剂盒推荐标准，计数30 个肿瘤细胞，统计 Ratio 值 ( Ratio 值= 30 个细胞核中绿信号总数/青信号总数)：TOP2A扩增标准：①TOP2A信号点呈点簇状或簇状；②TOP2A/CSP17比值≥2.0。TOP2A缺失标准：TOP2A/CSP17比值≤0.8。HER-2的IHC与FISH检测采用中国乳腺癌HER2检测指南(2019版)判读标准[2]。ER 、PR的IHC结果判读依据采用《乳腺癌雌、孕激素受体免疫组织化学检测指南(2015 版)》[3]。分子分型依据2013年St Gallen会议专家共识[4]分为Luminal A 型(ER+和/或PR+、HER2-、Ki67<14%)；Luminal B型(分2种：一种是ER+和/或PR+、Ki67≥14%；另一种是ER+和/或PR+、HER2+)；HER-2 过表达型(ER-、PR-、HER2+、Ki67高表达)；基底细胞型(ER-、PR-、HER2-)。

1.5 统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行分析，计量资料用Spearman行相关性分析，计数资料组间比较以χ2检验或Fisher精确概率法进行率的比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌TOP2A基因变异与HER2基因相关性分析 桂西地区109例乳腺癌患者中TOP2A基因扩增26例，变异率23.85%(26/109)，缺失5例，变异率4.59%，总变异病例数31例，总变异率为28.44%(31/109)。HER2和TOP2A基因共扩增26例，有5例TOP2A基因缺失而HER2基因扩增的现象，另有23例TOP2A基因无变异表达病例中存在HER2基因扩增；HER2基因变异率高于TOP2A基因。TOP2A基因变异与HER2基因变异有相关性(r=0.614，P=0.00)；TOP2A基因变异与HER2蛋白变异有相关性(r=-0.312，P=0.001)，见表1、图1。

表1 TOP2A基因变异与HER2基因表达相关性分析

图1 TOP2A基因表达的FISH检测结果图

注：a为TOP2A基因未扩增；b为TOP2A基因扩增；c为TOP2A基因缺失

2.2 TOP2A基因变异与临床病理特征的关系 TOP2A基因变异与患者年龄、肿瘤大小的表达无统计学意义(P>0.05)；淋巴结转移、组织学分级，在TOP2A基因扩增、缺失、正常构成比上差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。TOP2A基因变异与淋巴转移状态和组织学分级相关(r分别为-0.276、-0242，P为0.04、0.01)。

表2 TOP2A变异与乳腺癌临床病理特征的关系 (n，%)

2.3 TOP2A基因在不同乳腺癌分子分型中的变异情况 TOP2A 基因在 Luminal A 型和基底细胞型病例中低表达，在HER2过表达型和Luminal B 型病例中高表达，TOP2A基因变异与乳腺癌临床分子分型无关(r=-0.182，P=0.059)。见表3。

表3 TOP2A基因在不同乳腺癌分子分型中的变异情况

3 讨论

乳腺癌是一种具有高度异质性的肿瘤，一方面表现在不同类型的肿瘤之间，或同一肿瘤内部之间的差异；另一方面，在组织病理分型、免疫组化特征的分型和基因表达谱的分子分型上也有不同。根据患者分子标志物指导的乳腺癌个体化治疗已成临床的共识。TOP2A基因与HER2基因均位于17号染色体上，TOP2A(17q 21-22)，HER2(17q12-21)位置相互毗邻，基因状态存在密切联系。Hicks DG等[5]研究发现HER2阳性的乳腺癌患者中有89%～90%的患者发生TOP2A基因扩增或缺失，而在HER2正常的患者中鲜有TOP2A基因变异。因此认为这两个基因是协同变异，HER2基因扩增后染色体重排，导致TOP2A基因扩增或缺失。在HER2基因正常的乳腺癌患者中也会出现TOP2A基因变异，Kim等[6]在HER2基因正常的样本中TOP2A基因扩增和缺失分别6.6%和3.7%，但在HER2扩增的样本中TOP2A基因扩增和缺失分别为26.4%和24%，因此认为TOP2A基因变异在HER2扩增的样本中更容易发生。TOP2A基因表达的拓扑异构酶(Topoismerase)是DNA复制和转录过程所需的关键核酶。TOP2A 基因变异的患者预后较差，生存期短，尤其是TOP2A 基因缺失的患者预后更差[7-9]。

本研究通过对桂西地区109例乳腺癌患者进行TOP2A基因、HER2基因、HER2蛋白、组织分型、分子分型等临床病理特征相关性分析，结果显示TOP2A 基因总变异率为28.44%，这与国内文献报道相似[10-11]。TOP2A 基因扩增与HER2基因的扩增及其蛋白过表达密切相关，多集中在HER2基因扩增的患者中，仅有1例TOP2A基因缺失发生在HER2未扩增的情况下。此外，TOP2A基因变异与转移淋巴结和组织分级也密切有关；TOP2A基因变异与乳腺癌的分子分型密切无关，在Luminal A型、基底细胞型中TOP2A基因变异率低，Luminal B型和HER2 过表达型中变异率高。TOP2A基因变异集中在分化差的肿瘤中，这提示TOP2A 基因变异与乳腺癌患者预后不良相关，TOP2A是乳腺癌预后预测指标。

新辅助化疗已经成为临床治疗乳腺癌的常用手段，但这些指标可以预测新辅助化疗的效率尚未形成统一的观点。有研究表明[13-15]，存在TOP2A基因扩增的患者在接受新辅助化疗后，有较好的总生存率(OS)和无病生存率(DFS)。而TOP2A基因缺失的机制其临床应用的意义尚未阐明，这是我们下一步研究的方向，以期为今后临床开展个体化治疗，提高临床治疗效果，提供参考依据。