ICR小鼠体内染色体畸变试验的优化*

霍桂桃 胡燕平 杨 莹 赵婷婷 宋 捷 汪 祺 文海若

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

外源物质或其代谢产物与体内DNA作用后可能产生损伤，其中不可修复的损伤随DNA复制最终可诱导癌症。发生于体细胞的染色体畸变是癌症发生的重要分子基础。染色体畸变试验(Chromosome Aberration Test,CAT)是一项以形态学观察为主的检测受试物对细胞染色体结构及数量潜在影响的经典遗传毒性评价方法，该方法的主要观察内容包括结构畸变(即染色体断裂、易位、交换等)和数目畸变(非整倍体或多倍体的形成)[1-2]。与观察突变或染色体损伤结果的小鼠淋巴瘤细胞试验和微核试验不同，染色体畸变试验可以直接对染色体损伤的具体形式和程度进行观察，在遗传毒理学研究中具有不可替代的作用。体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是药物、化妆品和医疗器械产品遗传毒性评价中的常规试验方法，而在新资源食品、食品添加剂和保健食品评价中通常开展啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验。此外，体内染色体畸变试验也是体内微核结果为阳性或可疑阳性的受试物的后续试验方法，并且在新药评价中也会涉及[3]。

染色体畸变试验的标本制备和阅片工作较为繁琐，而且需要一定的经验。能否通过适宜的试验条件在捕捉染色体损伤峰值出现的同时保证良好的中期分裂相制片效果是获得客观评价结果的基石。如秋水仙素(Colchicine,COL)造模、低渗处理、高空滴片等过程，均会对中期分裂相的分散程度及制片效果产生影响[4-5]。在监管领域中，用于药物或保健食品的体内染色体畸变试验分析的中期分裂相细胞通常为骨髓中的有核细胞，且淋巴细胞占大多数。因淋巴细胞较体外试验所用的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)、中国仓鼠肺细胞(China Hamster Lung，CHL)等细胞小，且每个细胞所需观察的染色体条数多(小鼠淋巴细胞正常染色体数目约36～46条，CHL细胞正常染色体数目范围是23～27条)，对体内染色体畸变试验的制片要求更高。OECD指导原则[6]建议啮齿类动物体内染色体畸变试验如为单次给药，应分别在给药后12～18 h和给药后24 h以后分别取材；如为多次重复给药，则可在末次给药后12～18 h取材。指导原则建议在小鼠取材前3～5 h 给与秋水仙素，也有文献报道秋水仙素的给药时间可在取材前2 h。可见指导原则仅对给药方式和取材时间提出框架范围，未作严格规定。而文献报道所用的试验条件各不相同。用于申报的试验数据，通常需来自标准化的试验流程，从而保证数据的有效性。故有必要比较不同的给药、取材方式对制片及观察结果的影响，从而对试验条件进行优化，使研究数据更好地为“三品一械”的监管服务。这也是本研究的重要意义所在。

虽然根据经济合作与发展组织(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD)颁布的指导原则[7]和食品安全国家标准[8]，无论大鼠或小鼠均可用于体内染色体畸变试验，但实际应用中多用小鼠。对于微核试验出现可疑阳性的药物来说，为与微核试验结果作有效对比，需使用ICR小鼠股骨骨髓细胞开展。因此本研究选择微核试验常用种属，即ICR小鼠开展骨髓染色体畸变试验，分别在不同时间点给予染色体断裂剂CP 及中期分裂相造模试剂COL，比较不同给药和取材时间点，以及不同给药浓度对小鼠骨髓细胞染色体畸变发生率的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1试剂：溶媒0.9%氯化钠注射液(sodium chloride injection，NaCl)购自石家庄四药有限公司；阳性试剂CP(批号：91K1176，纯度≥纯度1)购自Sigma Aldrich，给药当日现用现配，配制浓度为4 mg/mL；胎牛血清(fetal calf serum,FBS)购自GIBCO公司；COL(批号：401181/151200,纯度≥度11)购自 Fluka公司；氯化钾(potassium chloride，KCl)购自Sigma Aldrich，使用去离子水配制为0.075 mol/L。Giemsa 染料购自Sigma Aldrich，临染色前1份Giemsa原液经9份1/15 mol/L磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L Na2HPO4溶液和1/15 mol/L KH2PO4溶液1∶1混合，pH6.8)稀释配制为10% Giemsa应用液。

1.1.2实验动物：SPF级ICR(CD-1)小鼠36只，给药时7～8周龄(购入时6～7周龄，体质量30～32 g，检疫期7 d)，均为雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK(京)2016-0011。动物在恒温(20～26)℃、恒湿(40%～70%)、各12小时明暗周期的条件下饲养，饲养密度为2～3只/笼。给予鼠全价颗粒饲料喂养，自由摄食及饮水。研究方案通过国家药物安全评价监测中心实验动物福利伦理委员会的伦理审查。

1.1.3仪器：NTS-1300 恒温振荡水槽，东京理化器械株式会社；CX-41光学显微镜，奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1动物分组及给药：36只小鼠购入后在检疫期第7天，根据体质量使用TOXSTAT2006数据统计分析软件随机分组，分组时个体体质量差异不得大于平均体质量的±20%。全部动物首先分为给药后18 h取材组和给药后24 h取材组，每组下设COL 4 mg/kg组(取材前4 h给予)和COL 10 mg/kg组(取材前2 h给予)给药组。不同COL浓度组以下，再分别设0.9% 氯化钠注射液溶媒对照组、CP 10 mg/kg组和CP 40 mg/kg组，每组3只。COL及CP取材时间及使用剂量根据指导原则及文献报道确定[3,9]。给药方式均为腹腔注射，给药体积均为10 mL/kg。试验设计详见表1。

1.2.2临床症状观察及体质量测定：给药期间每天上午和下午对所有动物进行隔笼观察，包括是否死亡、濒死、活动状况、外观及被毛、有无外伤、粪便情况等；给药前、给药期间及解剖前对动物进行称重。

1.2.3取材及标本制作：在动物解剖取材日，采用CO2吸入法麻醉处死动物，然后摘取双侧股骨制作骨髓标本。用胎牛血清将股骨中骨髓冲下制备骨髓细胞悬液；将骨髓悬液经1 000 r/min离心5 min，弃去大部分上清液，留适量上清将骨髓细胞沉淀充分吹打均匀；每个样本中加入7 mL 37 ℃预热的0.075 mol/L KCl溶液,轻轻混匀细胞后，将样本置于37 ℃条件下低渗处理约40～60 min。低渗处理后，加入固定液(甲醇∶冰醋酸比例约3∶1)3 mL预固定样本，以1 000 r/min离心10 min，弃上清;加入3 mL固定液，固定20 min后以1 000 r/min离心5 min，弃上清；用吸管将细胞团块打碎，加入5 mL固定液，37 ℃水浴固定20 min后以1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入0.5 mL固定液，将沉淀物吹打混匀。滴片(30 cm左右高度滴4～5滴在预冷的玻片上，细胞自然分散)制备标本(3～5张/只)，室温自然风干。

表1 分组及试验设计Table 1 Grouping and test design

10%Giemsa(1份Giemsa原液与9份pH6.8磷酸缓冲液混合)染色30 min后，以蒸馏水或自来水冲洗玻片。染色后的玻片存放于标本盒中待镜检观察。

1.2.4取材及标本制作:取染色玻片标本，在显微镜下(放大倍数为400～1 000倍)进行观察。每只动物至少分析100个中期分裂相细胞。记录每个细胞的染色体结构畸变的畸变类型，包括染色单体裂隙(ctg)、染色体单体断裂(ctb)、染色单体交换(cte)、染色体裂隙(csg)、染色体断裂(csb)、染色体交换(cse)、碎片化(frg，可见10个以上断片)，及是否为多倍体(pol)。根据以上结果计算出各组平均结构畸变细胞率(不含ctg及csg，AC%)、结构畸变细胞率(含ctg及csg，ACG%)、多畸变细胞率(不含ctg及csg，MAC%)及多倍体细胞率(PC%)。正常骨髓有核细胞及存在结构畸变和数目畸变的骨髓有核细胞中期相染色体图例如图1所示。

图1 正常及异常ICR小鼠骨髓细胞染色体注：ICR小鼠骨髓染色体标本经Giemsa染色后，在油镜(×1000)下观察到的正常染色体(A)、结构异常(B-C，包括裂隙及断裂)及多倍体(D)结构示意。Fig.1 Normal and aberrated chromosome in ICR mouse bone marrow cellsNote：The normal chromosome (A),structural abnormalities (B-C,including gaps and breakage)and polyploid (D)observed in the ICR mouse bone marrow chromosome specimens after the Giemsa staining under an oil immersion lens(×1000).

1.3 统计方法

2 结果

2.1 整体毒性评价

给药后试验动物的临床症状观察和体质量变化是衡量受试物对动物毒性程度的重要指标。实验期间各组动物未见与给药相关的异常临床症状或死亡。各组动物的体质量在各个时间点与同期本组对照组动物相比未见差异(P>0.05，表2)，提示本研究所选用的CP及COL浓度对动物整体无明显直接毒性作用，给药方式可行。

表2 各组动物体质量测定结果Table 2 Body weight measurement results of each group

注：单因素方差分析
Notes:one-way ANOVA

2.2 染色体畸变分析结果

2.2.1不同给药浓度及取材时间点染色体畸变类型的关系

与各小组内的溶媒对照组相比(表3及图2)CP18 h-COL4h组、CP18 h-COL2h组、CP24 h-COL4h组、CP24 h-COL2h组的AC%、AGC%和MAC%均显著性升高(P<0.01)；每小组内CP高剂量组AC%显著性高于CP低剂量组(P<0.01)，CP剂量较高时产生的染色体畸变更为严重，与阳性剂CP的预期结果相符。试验期间低剂量给药2次，高剂量给药1次，因此上述结果也提示 CP所致染色体畸变与给药次数关系较小，与单次给药浓度和给药时间点关系较大。从COL使用剂量及取材时间角度分析，CP18 h-COL4h组的AC%、ACG%和MAC%均低于CP18 h-COL2h组，并存在显著性差异(P<0.05)，提示使用高剂量的COL(10 mg/kg)尽管作用时间缩短，亦可产生额外的染色体损伤。

图2 不同给药浓度及取材时间点与染色体畸变类型分布的关系注：不同给药取材方式对各组平均AC%(不含ctg及csg,A)、ACG%(含ctg及csg，B)、MAC%(不含ctg及csg，C)及PC%(D)的影响。卡方检验，与同给药取材时间点溶媒对照组比较。*P<0.05,**P<0.01；动物数n=3Fig.2 Relationship between different dose concentrations and sampling time points and distribution of chromosome aberration typesNote：The effects of different administration and sampling strategies on the average AC% (excluding ctg and csg,A),ACG% (including ctg and csg,B),MAC% (excluding ctg and csg,C)and PC% (D)of each group.Chi-square test，Compared with the vehicle control group at the same administration and sampling time point,* indicates P<0.05 compared with vehicle control group；**indicates P<0.01 compared with vehicle control group.The number of animals n=3.

然而，PC%未呈现剂量反应相关性。与各小组内的溶媒对照组相比，CP18 h-COL4h组、CP18 h-COL2h组的PC%未见明显升高(P>0.05)；而CP24 h-COL4h组中，CP低、高剂量组PC%均显著性降低(P<0.05,P<0.01)，可能与该作用条件下导致大量染色体断裂，多倍体数相对降低有关。溶媒对照组染色体结构畸变较少，分散相更为清晰且结构相对完整，故更易观察到多倍体的现象。因多倍体细胞数与使用COL有关，染色体畸变试验结果无法对受试物是否诱导多倍体产生作判断。

2.2.2不同CP给药浓度下染色体结构畸变类型分布关系

针对不同的结构畸变类型(裂隙、断裂和交换)进行分析发现(表3与图3)，溶媒对照组中的结构性畸变类型绝大多数为裂隙，断裂较少，未见染色体交换；CP低剂量组中3类结构性畸变数目明显增加，虽大多数畸变仍表现为裂隙，但断裂和交换的出现率相加可与之持平；在CP高剂量组中3类染色体畸变数量相近，染色体交换数目明显增加。以上趋势在4个不同给药取材点均可观察到。染色单体及染色体裂隙认为是可修复的畸变类型，通常不计入结构畸变统计中；而染色体单体及染色体断裂是CP的最主要畸变类型，上述结果与预期及文献报道基本相符[9]。

图3 不同CP给药剂量与染色体结构畸变类型分布关系注：溶媒对照组(A)、10 mg/kg CP组(B)与40 mg/kg CP组(C)各300个细胞中裂隙、断裂及交换数汇总，动物数n=3Fig.3 Distribution of Chromosome structural aberrations in different doses of CPNote：Summary of numbers of gaps,breaks and exchanges in 300 cells of vehicle control group (A)、10 mg/kg CP group (B)and 40 mg/kg CP group (C),respectively.The number of animals n=3

表3 染色体畸变分析结果Table 3 Chromosome aberration analysis results

注：1.每组3只动物，各分析100个中期分裂相细胞，每组共统计300个细胞.2.ctg、ctb、cte：分别表示染色单体裂隙、断裂、交换；csg、csb、cse：分别表示染色体裂隙、断裂、交换；frg：10个以上断片(含交换).3.AC：结构畸变细胞数(不包括裂隙)；ACG：结构畸变细胞数(包括裂隙)；MAC：多畸变细胞数(不包括裂隙)；PC：多倍体细胞数.卡方检验，同组0.9% NaCl对照组：*P<0.05,**P<0.01；同组CP低剂量组：#P<0.01；同剂量CP 18 h组：△P<0.05,△△P<0.01；同剂量COL组▲P<0.01
Notes：1.3 animals per group,Analysis of 100 metaphase dividing cells.A total of 300 cells were counted in each group.2.ctg/csg,ctb/csb and cte/cse represent chromatid gap/chromosome gap,chromatid break/chromosome break and chromatid exchange/chromosome exchange respectively.frg:represent more than 10 fragments (including exchange).3.AC:aberration cell (include gap);ACG:aberration cell (exclude gap);MAC:multiple aberration cell (exclude gap);PC:polyploidy cell.;Chi-square test showed that 0.9% NaCl control group in the same group;*indicatesP<0.05 compared with vehicle control group;**indicatesP<0.01 compared with vehicle control group;#indicatesP<0.01 compared with Low dose group of CP in the same group;△indicatesP<0.05 compared with the same dose of CP for 18 h group;△△indicatesP<0.01 compared with the same dose of CP for 18 h group;▲indicatesP<0.01 compared with the same dose of COL group

3 讨论

与体外哺乳动物染色体畸变试验相比，体内试验所观察的啮齿类动物淋巴细胞所包含的染色体条数较多而细胞较小，因此后者需制备分散情况更好的染色体标本用于观察。中期分裂相细胞染色体分散情况主要与给药时间点、取材时间点、给药浓度、低渗处理条件等有关[10-11]。本研究主要就不同的给药剂量，给药时间及取材时间对制片效果的影响进行对比。

染色体畸变试验的观察对象为处于中期分裂相的细胞，为增加中期分裂相细胞比例，早期研究中使用植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA)刺激细胞分裂，提高骨髓和淋巴细胞等的分裂指数[12]。OECD指导原则中建议使用纺锤丝形成抑制剂COL来获得更多的中期分裂相细胞用于分析[6]。但COL同时也是染色体畸变的阳性剂，其剂量过高时可导致细胞核固缩，反而干扰了制片后染色体的分散效果，难以对畸变类型进行细致的观察[13-14]。OECD指导原则及我国食品安全国家标准均建议的秋水仙素给药时间为取材前3～5 h。而国内外文献报道中秋水仙素实际使用剂量2～4 mg/kg不等[15-18]；为便于操作，给药时间为取材前为1.5～4 h。本研究的结果提示虽然无论取材前4 h(4 mg/kg)或2 h(10 mg/kg)给予COL,每只动物均可获得至少100个处于中期分裂相的细胞，但10 mg/kg的COL可诱导额外的染色体结构性畸变。而CP 18 h-COL 4 h组与CP 18 h-COL 2 h组染色体样本中染色体分散效果较好，镜下可观察到较多处于中期分裂相的细胞(约占总有核细胞数的10%左右，数据未显示)。

在CP的给药剂量和时间的选择方面，由于CP处理导致染色体出现较多结构性断裂，滴片时易将多数已胀裂核膜的染色体标本断片进一步摔碎，无法观察。因镜下观察阳性剂量组染色体标本核膜胀裂不充分的情况相对较多，试验时应合理设置CP的给药剂量。此外，CP 24 h-COL 4 h组和CP 24 h-COL 2 h组两组染色体分散效果相对较差，可见未成熟染色体凝缩现象，多见染色体细长，从而影响了染色体分析结果的准确性。上述情况均与给药取材时间点与细胞周期不协同有关，因大多数细胞未处于细胞分裂中期。在这一条件下，某些结构性畸变可能被忽视，裂隙与断裂的差异则难以区分，故阴性对照组的畸变率较低，CP 24 h-COL 4 h组和CP 24 h-COL 2 h组中的结构畸变率可能被低估。如图2所示，CP 24 h-COL 2 h组的CP低剂量组与高剂量组间的结构性畸变率差异被弱化；CP 24 h-COL 4 h组的CP高剂量组的AC%较CP 18 h-COL 4 h组的CP高剂量组显著增高(图3)。故取材和给药时间设为CP在取材前18 h给药，COL在取材前4 h给药较为理想。

除了给药及取材因素外，其它制片流程也可能影响染色体分散效果。如，制片所用玻片，建议提前使用95%酒精浸泡擦拭，从而减少背景沉渣。骨髓染色体样本经37 ℃条件下低渗处理30至60 min可完全胀裂溶解红细胞，并充分胀裂白细胞核膜。此外，滴片高度也对染色体分散程度有一定影响。

2011年在人用药物注册技术要求国际协调会(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)颁布的药物遗传毒性研究技术指导原则的修订草案ICH S2(R1)[19]中强调了体内研究可将多种遗传毒性评价方法联合开展。在药物安全性评价领域，通常在骨髓微核试验结果不明确或为阳性时开展体内染色体畸变试验，对受试物对体内染色体损伤效应进行确认。本研究结果提示间隔24 h连续两次给药后18 h取材可获得较优的染色体畸变试验制片效果，而骨髓微核试验亦可使用相同的给药及取材方式。故两者可使用同一批动物开展，从而更好地对微核试验的结果进行验证。而实际给药频率和给药方式要根据不同受试物的实际人体使用方式、剂型、作用机制或国标要求进行调整。本研究对试验条件的摸索积累了一定的背景数据，也为相关研究人员提供借鉴。此外，结果提示间隔24 h连续两次给药后18 h取材可获得较优的制片效果。