颅脑损伤后认知障碍大鼠模型的制备及评价*

郭新荣 马小卫

(1.陕西中医药大学针灸推拿学院，西安 712046)(2.陕西中医药大学教务处，西安 712046)

颅脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)是临床常见创伤之一，常导致意识丧失、失语、眩晕、头痛、认知障碍及各种神经功能障碍等[1]。患者多以青壮年为主，男性居多，认知障碍(Cognitive disorder，CD)为多数患者伴有的最持久和最严重的症状之一，特别是学习新知识的能力减退[2-3]，给个人、家庭和社会带来了沉重负担[4]，故对TBI认知功能障碍的有效防治引起了越来越多的医学研究者的关注[5]。在科学研究工作中急需寻求一种能够较好模拟认知障碍，同时稳定性、重复性好，便于操作的动物模型平台及评价体系，目前此方面研究较少，本实验探索了TBI后认知障碍大鼠模型的制备及评价，报道如下：

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康清洁雄性SD大鼠60只，体质量220～240 g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(陕)2012-003号。自然光照，自由饮水、进食，温度18～24 ℃、湿度60%～70%，严格按照2006年国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导意见》管理动物。动物适应性喂养3 d，水迷宫筛除不适合纳入实验的大鼠12只，其余动物按随机数字表分为空白组10只，假手术组10只，模型组28只。

1.2 主要药品及试剂

戊巴比妥钠(57-33-01)；盐酸利多卡因注射液(161093)；注射用氨苄西林钠(华北制药股份有限公司，批号：D1604204，0.5 g/支)；Rat MMP-2、Rat MMP-9、Rat SOD、Rat MDA ELISA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要仪器

微型磨钻；脑立体定位仪(ST-3ND型，成都仪器厂)；电子颅脑损伤仪(eCCI-6.3，美国VCU 大学)；自动酶标仪(美国Molecular Devices公司 SpectraMax5)；台式离心机(TL-4型，湖南仪器仪表总厂离心机厂)；恒温水浴锅(SHHW21.60A11型，天津市泰斯特仪器有限公司)；水迷宫(上海移数鼠博士，RD1101MWM-G)等。

1.4 各组动物处理

模型组：颅脑损伤动物模型制备：(1)术前禁食禁水8 h；(2)腹腔内注射2%的戊巴比妥钠(45 mg/kg体质量)进行麻醉；(3)将大鼠俯卧位固定于脑立体定向仪上；(4)头顶正中皮肤碘伏、酒精消毒，正中切开，剥离骨膜，暴露右顶骨；(5)利用脑立体定位仪进行定位，在冠状缝后3 mm、中线右侧旁开2.5 mm处[6]制作标记；然后以标记点为圆心、用微型磨钻钻半径为2 mm的骨窗，保持硬脑膜完整。利用游标卡尺进行测量确保所开骨窗直径为4 mm，否则进行修整；(6)将大鼠移置到eCCI操作台上，进行打击(速度4 m/s、深度3 mm)，撞击杆撞击硬膜，使脑组织产生瞬间形变；(7)打击后创面如有出血，用消毒干棉球进行压迫止血；后利用注射器向伤口处滴注 4万单位硫酸庆大霉素 4～5 滴，用骨蜡封闭骨窗；(8)用1.0号手术线缝合头皮；(9)术后处理：缝合后立即用红霉素软膏涂抹缝合处及周围。将大鼠放在棉垫上，保持呼吸畅通，注意保暖，约2～3 h，待大鼠完全苏醒后放回鼠笼中饲养；(10)术后抗感染：注射氨苄西林钠，每次用量125 mg，生理盐水稀释后，腹腔注射，每日1次，连用3 d。

空白组：不做任何处理。

假手术组：同模型组开颅，但不打击。

1.5 TBI认知障碍动物模型筛选

待以上手术动物恢复3 d后，将模型组所有动物进行水迷宫实验(仅进行定位航行实验)，将各自的总成绩计算，并排序。有研究[7]指出70%～80%的脑外伤幸存患者存在认知功能障碍，故本实验选取前70%的动物纳入实验研究。

1.6 术后大鼠生命体征、神经功能及运动功能评价方法

1.6.1观察实验大鼠受到外伤后出现的生命体征变化，并且记录打击后出血量的情况、呼吸、抽搐、意识障碍、致死情况。

1.6.2神经行为能力[8]:制作一个长30 cm、宽30 cm的木板。参考Faden等使用的大鼠实验性颅脑创伤神经功能行为评分标准，具体评价标准：大鼠在30度倾斜板上保持位置的能力(包括垂直、左右两侧水平三种方向)；悬吊大鼠尾部，左右前肢屈曲能力；对抗左右两侧牵拉的能力。每项0～5分(重伤—-正常)，正常大鼠计分应为15分。

1.6.3大鼠平衡功能试验[8]:制作一根长30 cm、宽1.5 cm的木条。当大鼠放置在木条上时，动物在木条上的平衡状态可作为评分条件。具体评分方法：1分，平稳不动；2分，比较平稳，稍微晃动；3分，较大晃动；4分，站在木条上一段时间后从悬挂在木条上掉下；5分，站在木条上一段时间后从木条上掉下；6分，无法站在木条上，立即从木条上掉下。评分越高，动物的平衡功能障碍越显著。

1.6.4鼠行走试验：具体方法[8]:行走试验是由一根长100 cm、宽1.5 cm木条和一个长20 cm、宽15 cm、高20 cm木盒组成。动物听到噪声时，大鼠会从木条一端逃到另一端木盒中。正常大白鼠通过若干次训练，能在5 s之内完成这个过程。通过测试大鼠完成行走试验的时间来判断动物的运动功能，时间越长，动物运动功能障碍越明显。测量时使用智能手机上自带的秒表计时器计时测量。

1.7 Morris水迷宫实验

1.7.1定位航行实验：大鼠依次从4个象限进入水中，若90 s内爬上平台，记录所用时间；若90 s内未找到平台，潜伏期则记录为90 s。连续训练4 d，每日上、下午各1次。每次的游泳结果，取四个象限的逃避潜伏期之和。动物在造模后第4天开始水迷宫实验，持续12次。

1.7.2空间探索实验：定位航行实验最后一次结束后1天的上午，撤除平台，将实验大鼠放入水中，观察、记录大鼠90 s内经过原平台所在区域次数。

1.8 血清MMP-2、MMP-9、SOD和MDA含量检测

待第12次水迷宫实验结束时，大鼠麻醉，腹主动脉取血，3 000转/分离心，取血清，-20 ℃冰箱保存以供检测使用。ELISA实验操作步骤按照试剂盒说明进行。结果判定：在Excel表中，以标准品浓度为横坐标、对应A值为纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.9 统计方法

2 结果

2.1 术后大鼠生命体征、神经功能及运动功能结果

2.1.1各组动物出血情况:根据eCCI不同强度打击动物出血量情况，采用团队前期研究制定[9]的分级标准，见表1。

2.1.2打击时大鼠抽搐、术后呼吸情况和存活情况，见表2。

表1 各组动物造模时出血情况Table 1 Bleeding in each group during modeling

注：模型组造模过程中死亡4只，存活24只；假手术组死亡2只，存活8只
Note:In the model group,4 rats died and 24 survived in the process of modeling;in the sham operation group,2 rats died and 8 rats survived

表2 各组动物造模后抽搐、呼吸情况和存活情况Table 2 Convulsion,respiration and survival of animals in each group after modeling

注：与假手术组比较，#P<0.01
Note:Compared with the Sham operation group，#P<0.01

2.1.3神经功能行为能力：术后当日，术后3日，实验结束时检测各组动物的行为学能力(见表3)，方法参考文献[10]。

表3 各组动物神经行为能力评分比较Table 3 Comparison of neurobehavioral abilities of animals in each group

注：与术后当日比较，#P<0.01；与术后3日比较，*P<0.01
Note:compared with the postoperative day,#P<0.01;compared with the postoperative day,*P<0.01

2.1.4大鼠平衡功能

术后当日，术后3日，实验结束时检测各组动物平衡功能结果，见表4。

表4 各组动物平衡能力评分比较Table 4 Comparison of balance ability of animals in each group

注：与术后当日比较，#P<0.01；与术后3日比较，★P<0.01
Note:compared with the postoperative day,#P<0.01;compared with the postoperative day,★P<0.01

2.1.5大鼠行走试验：术后当日，术后3日，实验结束时检测各组动物行走功能情况。测量时使用智能手机上自带的秒表计时器，见表5。说明正常动物均能够在5秒内完成行走试验。

表5 各组行走试验的时间(s)比较Table 5 Comparison of walking test

注：与术后当日比较，#P<0.01；与术后3日比较，★P<0.01
Note:compared with the postoperative day,#P<0.01;compared with the postoperative day,★P<0.01

2.2 Moriss大鼠水迷宫评价

2.2.1大鼠水迷宫潜伏期实验：结果见表6，图1。

表6 大鼠水迷宫潜伏期时间比较Table 6 Comparison of latency of water maze in rats

注：与空白组比较，#P<0.01；★P>0.05
Note:compared with the blank group,#P<0.01；★P>0.05

图1 水迷宫典型轨迹图Fig.1 typical path of water maze

2.2.2空间探索实验：结果见表7。

表7 各组大鼠穿过平台所在位置数次)Table 7 number of positions of rats in each group passing through the platform times)

注：与空白组比较，#P<0.01；★P>0.05
Note:compared with the blank group,#P<0.01;★P>0.05

2.3 血清中认知障碍标志物MMP-2、MMP-9、SOD、MDA含量

2.3.1MMP-2、MMP-9蛋白含量：当动物实验终止时，腹主动脉抽血，对各组动物血清中的MMP-2、MMP-9含量进行了检测，结果：与空白组比较，模型组血清MMP-2、MMP-9含量明显上升(P<0.01)，而假手术组含量没有变化(P>0.05)，见表8。

表8 血清中MMP-2、MMP-9含量的情况Table 8 contents of MMP-2 and MMP-9

注：与空白组比较，#P>0.05;与空白组、假手术组比较，*P<0.01
Note:Compared with the blank group,#P>0.05;Compared with blank group and sham operation group,*P<0.01

2.3.2血清中SOD、MDA含量：当动物实验终止时，腹主动脉抽血，对各组动物血清中的SOD、MDA含量进行了检测，结果：与空白组比较，模型组血清SOD含量明显下降(P<0.01)，MDA含量明显上升(P<0.01)，而假手术组SOD、MDA含量均没有变化(P>0.05)。见表9。

表9 血清中SOD、MDA含量的情况Table 9 content of SOD and MDA in serum

注：与空白组比较，#P>0.05;与空白组、假手术组比较，*P<0.01
Note:Compared with the blank group,#P>0.05;Compared with blank group and sham operation group,*P<0.01

3 讨论

本研究选用动物模型制备的基本方法笔者已发表过相关研究论文[11]；团队近年一直使用本造模方法，该方法稳定，可靠性较强。本次为了进一步研究TBI后认知功能障碍的发生，在原有模型基础上引入了水迷宫筛选。结合水迷宫研究结果，我们发现模型组动物与空白组、假手术组比较水迷宫实验潜伏期大大延长、空间探索实验也表现较差，确实发生了认知功能障碍；同时，空白组和假手术组比较没有差异，这说明除打击导致颅脑损伤外，手术等操作没有造成影响。同时，实验也对大鼠生命体征、神经功能行为学及运动功能进行了研究，结果显示：SD大鼠颅脑受到手术、外力打击后，动物出血量增加，呼吸减慢，死亡动物数也随之增加。于打击后当日动物苏醒后，对其神经功能、平衡能力、行走能力进行了评价，显示结果与空白组比较，造模组有显著性差异，假手术组也有差异。造模后第3日进行评估，假手术组神经功能、平衡、行走能力均明显恢复；但是，模型组动物神经功能、平衡、行走能力虽然均有明显恢复，但是仍然存在显著性差异。当实验结束时，模型组动物神经功能、平衡、行走能力均明显改善，同术后3日点比较，均有明显改善，但是，与正常组比较，仍然存在差异。结果说明这一模型制备策略稳定可靠，可供同类研究使用。

进一步实验选择了具有认知障碍标志物的公认指标基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)进行研究。MMP是一组锌离子依赖的内肽酶家族[12]，目前已发现人类MMPs 有20多种，其中MMP-2、MMP-9是MMPs 家族的核心成员，与阿尔茨海默病(AD)的关系密切，影响其发生发展；近年来成为一种认知功能障碍的标志物，越来越多地被应用在认知障碍的研究中。SOD是细胞内生的氧自由基清除剂可以清除体内代谢产生的氧自由基；MDA是氧自由基作用于细胞膜脂的产物，其浓度变化能够间接反映氧自由基的含量变化，两者作为细胞代谢的一对研究指标，已经是目前已经被许多研究所公认的结果。许多学者[13-14]将SOD、MDA作为研究颅脑损伤认知功能的重要观察指标之一。本研究将血清中MMP-2、MMP-9、SOD和MDA作为TBI后认知障碍标志物进行观察，是否能得到理性的效果呢？在实验中，探索TBI后认知障碍的动物模型制备效果，结果发现模型组动物血清中MMP-2、MMP-9、MDA含量明显升高，但是，假手术组和空白组均表达低水平，且两组之间比较没有差异；发现模型组动物血清中SOD含量明显下降，同样，假手术组和空白组均表达一般水平，且两组之间比较没有差异。这些观察结果证明了TBI后认知障碍大鼠血清中MMP-2、MMP-9、SOD和MDA含量确实发生了变化；同时也说明我们使用血清中这4种物质的含量变化作为TBI后认知障碍观察标志物是可行的；也从一定程度证明我们制备的TBI后认知障碍的有效可靠性。

综上，本实验研究了TBI后认知功能大鼠模型制备的策略和评价方法，使用水迷宫筛选、检测血清中MMP-2、MMP-9、SOD、MDA的含量等是可靠度较高的评价方法，本模型制备方法操作可行，结果可靠，可供同类研究应用。