MuSK重症肌无力小鼠模型的建立*

刘潺潺 李 婷

(中国科学院大学深圳医院(光明)，深圳 518000)

重症肌无力(MG)是一种神经肌肉接头的自身免疫性疾病，早在1973年在MG患者身上发现乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)，2001年在MG患者中才又发现了一种新的抗体，肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体(MuSK-Ab)。乙酰胆碱受体(AchR)和MuSK抗体阳性的MG是具有独立免疫学靶点的自身免疫性疾病。与神经肌肉接头功能障碍的机制不同，两者临床表现与治疗差别很大[1]，比如MuSK MG经常呈现近端肩胛肌和面部肌无力的特征性临床表现，更多的肌无力危象和呼吸衰竭，长期预后较差。在突触形成过程中，MuSK能调节AchR聚集，所以MuSK能维持AchR的正常空间结构，从而保障突触功能。国外报道AchR抗体阴性的患者，MuSK抗体阳性占 38%～47%左右，相当于所有MG患者中的10%左右。MuSK-MG患者胸腺增生少见，胸腺瘤罕见，而且胸腺切除术后MuSK抗体血清保持不变，所以胸腺切除对MuSK患者疗效较差，构建MuSK-Ab小鼠模型有利于该疾病的研究[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：6～8周的雌性C57BL/6小鼠,购于华中科技大学实验动物中心，生产单位为三峡大学实验动物中心，许可证号SCXK(鄂)2017-0012。

1.1.2试剂：MuSK-弗氏佐剂(Difco，Detroit，MI，USA),鼠源肽，CFA完全费氏佐剂。

1.2 方法

1.2.1MuSK小鼠模型的制备

雌性C57BL/6小鼠40只，分成实验组和对照组，每组各20只小鼠。通过胰岛素注射器从尾静脉给药2次对小鼠进行免疫。第1次实验组20只小鼠麻醉并用30μg的MuSK-弗氏佐剂免疫，对照组20只小鼠仅用CFA免疫。28 d后进行第2次免疫：实验组给予MuSK-弗氏佐剂，对照组给予等量PBS。适应饲养1周后进行造模。造模第1天在 4个位置(两只后脚和肩部)分别注射免疫抗原(每个部位50 μL，含12.5ug鼠源肽，CFA完全费氏佐剂)；造模第30及50天再次在上述4个位置(两只后脚和肩部)分别注射免疫抗原(每个部位50 μL，含12.5ug 鼠源肽，CFA不完全费氏佐剂)[2]。参照文献要求[1]，实验组第2次免疫后每周测抓力，做翻笼试验，每天测临床评分和体质量，第70天后每天对发病情况进行评分。

1.2.2临床检查：临床检查是先将小鼠在平台上放置3 min，观察小鼠的精神状态，有无虚弱，脱水，小鼠的活动情况，四肢肌力，有无瘫痪等，以便与锻炼后情况进行对照。对小鼠按下面的标准进行评分。

(1)按国际重症肌无力小鼠临床评分标准进行评分(Clinical scores)[2]:首先进行标准锻炼，放置金属网格，轻抓小鼠的尾巴，小鼠抓住金属网格时，再将老鼠提起，如此重复20次，然后让小鼠自由行走并进行测分：

1)0分，锻炼前活动正常，没有虚弱或疲劳的迹象。在标准锻炼后，老鼠似乎比正常情况下不太活跃，或显示出其他轻微疲劳虚弱的迹象，

2)1分，锻炼前活动正常，但在标准的锻炼方案后，它会俯卧不动，下巴着地，不能抬头，缩成一团，活动性减少，头部和尾巴搁在工作台上(悬挂时间小于60 s)。当小鼠达到这个等级时，应将柔软、潮湿的食物放在笼子的地板上。

3)2分，锻炼前小鼠即出现活动性减少，常俯卧不动，头部及尾巴搁在工作台上，缩成一团，但未出现脱水，瘫痪，很大程度上保持着脑袋不动和尾巴休息(悬挂时间小于30 s)。

4)3分，小鼠即非常虚弱，脱水，瘫痪，体质量明显下降。评分为3分的小鼠出现脱水和瘫痪，体质量下降达15%(悬挂时间=0)。

5)4分，小鼠死亡。

(2)抓力试验和翻笼试验

1)抓力试验(Grip strength)

轻抓小鼠的尾巴，当小鼠悬起时，下面放金属网格，老鼠抓住金属网格时，将老鼠提起，重复20次后测拉力。

一端固定在拉力器上，测力器做成前端网格形。抓住小鼠尾巴，让小鼠抓住测力器的前端，用力拉小鼠的尾巴，当小鼠力量不够抓住测力器前端时，此时测力器显示为抓力。

2)翻笼试验(Inverted screen test)

翻笼试验是用来定量评估四肢肌力的测试方法。小鼠被放在了网格的中心后立即旋转到倒立位置，稳定地保持在软垫上方50 cm。记录小鼠掉下的时间,观察时间限定在300 s。

1.3 统计分析

使用SPSS19.0软件进行统计分析,MuSK-MG小鼠建模成功率采用卡方检验，以P<0.05为统计学有意义。

2 结果

评分结果见表1，评分为≥1提示造模成功，建模成功率50%；3分和4分的小鼠抓力试验和翻笼试验明确减退，有利于下一步药物试验。评分为1至4分为造模成功，成功率为50%，P=0.00026，见表1。

表1 评分结果Table 1 Mouse clinical score results

3 讨论

AchR自身抗体主要在免疫球蛋白G(IgG)IgG1和IgG3亚型中，直接阻断受体功能。相比之下，MuSK抗体主要是IgG4，不激活补体，而是抑制MuSK在终板诱导AchR的正常聚集[3]。肌肉活检和上肢肌肉的电生理研究没有显示任何AchR减少或补体沉积在MuSK阳性的MG中。MuSK-Abs的致病性已经通过患者纯化IgG被动转移到实验动物上得到证实[4]。与正常对照相比，MuSK-Ab 阳性的MG患者辅助性T细胞(Th)Th 1和Th17水平更高，而B10细胞百分比更低。由于B细胞10是免疫耐受和免疫激活调节的基础，这些结果与Th1 /Th17介导的炎症反应和自身抗体产生是一致的，是 MuSK-MG的主要机制[5]。

MuSK-MG的小鼠模型中最近研究结果表明，吡斯的明加剧了终板AchR损失，而3,4-二氨基吡啶增强了神经肌肉传递[6]。

C57BL/6、AJ 和 bm12小鼠容易造模，但是BALB/c不适合用来做MuSK小鼠模型。A/WySnJ,A/J,DBA/2,FVB/N小鼠更适合作为造模小鼠，具体原因不明[7]。必须定期监测动物，并防止不必要的痛苦。在开始治疗前几天开始的被动免疫注射过程中，每天都要进行体质量和疲劳虚弱的测量，以使动物熟悉操作人员。主动免疫研究的时间较长(4至11周)。对于这类研究，在第2次免疫接种之前，可以接受较不频繁的例行检查，到第2次免疫接种时应开始每日检查。由于老鼠有一个昼夜节律的活动周期，一个有规律的12小时的光/暗周期应该在每天的同一时间进行，最好是上午10点到下午1点[8-9]。

本研究按照国外文献制备MuSK-MG的小鼠模型，统一测评方法，与现有研究结果一致，造模方法可行。有利于重症肌无力疾病的进一步研究。