菠萝皮渣糯米果酒发酵中成分变化及抗氧化研究

林丽静，马丽娜，2，黄晓兵，龚霄，吴子健

（1.中国热带农业科学院农产品加工研究所，海南省果蔬贮藏与加工重点实验室，广东湛江524001；2.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070；3.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

菠萝[Ananas comosus （L）Merrill]属于凤梨科（Bromeliaceae），凤梨属（Ananas Merr.）多年生单子叶常绿草本植物，是世界三大重要热带水果之一。菠萝原产于南美洲巴西、巴拉圭的亚马逊河流域等热带地区，现在世界82 个以上的国家种植，菠萝是一种多汁、香气突出且营养价值高的热带水果。成熟的菠萝果实中含有丰富的糖、矿物质、有机酸、维生素和蛋白酶等，脂肪和胆固醇含量较低[1]。菠萝在加工生产过程中能产生25%~50%的加工副产物[2-3]。研究表明这些菠萝皮渣同样含有丰富的汁，风味和营养成分与果肉相差较小，其中新鲜菠萝皮渣水分含量为81.34%，0.60%～0.77%的有机酸，22 mg/100 g VC，6.10%总糖，2.50%还原糖含量，蛋白质含量为0.64%，总酸含量为2.09%，脂肪含量为0.32%，金属元素如K、Ca、Zn 等含量较高[4]。为充分利用资源，国内外对菠萝皮渣的开发利用进行了大量研究，主要是从加工副产物中提取黄酮、多酚等功能活性成分、发酵沼气和饲料等，对菠萝废弃物发酵果酒也有研究[5-6]。

本试验采用菠萝皮渣发酵果酒，并与我国传统的糯米酒混合发酵，研究菠萝皮渣糯米果酒在发酵过程中，糖度、蛋白质、黄酮、多酚等主要功能成分以及抗氧化作用，全面研究菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中物质变化规律，为菠萝皮渣的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菠萝（卡因品种）：广东省湛江市；白砂糖：湛江华资农垦糖业发展有限公司广丰分公司；QA23（简称Q）酵母：上海杰兔工贸有限公司；单糖标准品（Fluka-73173）、65%~68%优级纯硝酸（Supelco-47267）、铁离子、铜离子标准溶液[优级纯（65%~68%）]、乙醇色谱纯（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；-OH 自由基试剂盒（100 管/96 样）、总抗氧化能力试剂盒（50 管/48 样）：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1780 紫外可见分光光度计、LC-20 A 高效液相色谱仪：日本岛津公司；SKD-1000 自动凯氏定氮仪：上海沛欧分析仪器有限公司；TR320 高温消解炉：北京绿野创能机电设备有限公司；Agilent 7900 电感藕合等离子质谱：美国安捷伦科技公司；WX-8000 微波消解仪：上海屹尧仪器科技发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菠萝皮渣糯米果酒发酵工艺流程

菠萝→清洗→削皮→菠萝皮渣榨汁→调配糖度到20%→100 ℃，30 min 杀菌→冷却→接种发酵→28 ℃主发酵7 d→过滤→加入30 %糯米酒后陈酿发酵60 d→过滤→澄清→罐装→菠萝皮渣糯米果酒

1.3.2 维生素C（VC）含量的测定

VC标准溶液配制：精密称取0.200 0 g VC，加20 mL乙酸溶液（2 mol/L）溶解后移入100 mL 棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，制备成2.0 g/L VC标准储备液。吸取5.0 mL 置于100 mL 棕色容量瓶中，加5 mL 乙酸锌溶液，用水稀释至刻度，混匀，得到0.1 g/L VC标准使用液。

VC标准曲线绘制：吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL VC标准使用液，分别置于10 mL 容量瓶中，各加0.3 mL乙二胺四乙酸溶液（0.25 mol/L）、0.5 mL 乙酸溶液（0.5 mol/L）、1，25 mL 固蓝盐B 溶液（2 g/L），加水稀释至刻度，混匀，室温（25 ℃）放置20 min 后，以零管为参比，于波长420 nm 下测定吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样品测定：精密吸取适当稀释后的样品1 mL，按上述标曲制作方法测定，根据标准曲线计算样品中VC含量。

1.3.3 黄酮、多酚含量的测定

黄酮测定：参照文献[7]，测定菠萝皮渣糯米果酒中总黄酮含量。采用芦丁标品作为对照品，质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：y=12.512x-0.028 8，R2=0.999 1。

样品吸取量为2mL 于10mL 容量瓶中，加0.05 g/mL NaNO20.50 mL，摇匀放置6 min，再加0.10 g/mL Al（NO3）3溶液0.50 mL，摇匀，放置6 min，再加0.04 g/mL NaOH溶液4 mL，用蒸馏水定容至10 mL，摇匀，放置15 min，以试剂空白为参比，于510 nm 处测定吸光度值。由回归方程计算样品总黄酮含量。

多酚测定：参照文献经过修改后测定菠萝皮渣糯米果酒中多酚含量[8]。以没食子酸为标准对照品，分别配成1.60、2.40、3.20、4.00、4.80 μg/mL 的没食子酸，作标准曲线，回归方程为：y=0.0861x+0.019 6，R2=0.999 3。

准确吸取150 μL 酒样置于10 mL 容量瓶中，依次加4 mL 10 %福林酚，3.2 mL 7 % Na2CO3放置1 h，在765 nm 下测定吸光度值。由回归方程计算样品多酚含量。

1.3.4 蛋白质含量的测定

样品前处理：吸取2 mL 菠萝果酒，移入干燥的100 mL 定氮瓶中，加入0.2 g 硫酸铜、6 g 硫酸钾及20 mL 浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶置于高温消解炉上。小心加热，待内容物全部炭化泡沫完全停止后，保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5 h~1 h，取下放冷。同时做试剂空白试验。

试样分析：向接收瓶内加入10.0 mL 硼酸溶液及1 滴~2 滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，将定氮瓶置于定氮仪上机检测。取下接收瓶以盐酸标准滴定溶液滴定至终点，颜色由酒红色变成绿色，pH 5.1。同时做试剂空白。

1.3.5 糖含量的测定

参照GB/T 5009.8-2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》。

样品前处理方法：吸取2 mL 菠萝皮渣糯米果酒于100 mL 锥形瓶中，加水30 mL，涡旋，离心取上清。

1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methylpyrazolone，PMP）衍生化：向水解干燥后得到的单糖样品中加入溶于无水甲醇的0.5 mol/L 的PMP 试剂和0.3 mol/L 的NaOH 溶液各0.5 mL，充分混匀后，水浴70 ℃反应30 min。冷却至室温（25 ℃），加入0.3 mol/L HCl 0.5 mL，充分混匀。加入1 mL 氯仿。充分振荡萃取，去除氯仿层，共萃取3 次。水层用0.22 μm 滤膜过滤后，待上机。

色谱条件：色谱柱：Thermo C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：0.1 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲溶液∶乙腈=82 ∶18（体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温为25 ℃；进样量：10 μL；波长：245 nm。

1.3.6 氨基酸含量的测定

样品前处理：取0.50 mL 菠萝皮渣糯米果酒于20 mL 的水解管中，加入16.00 mL 6 mol/L 的盐酸溶液，真空脱气30 min，充氮封管，在110 ℃下水解22 h~24 h，取出冷却后，转移至50 mL 容量瓶中，并用去离子水定容。准确取1 mL 水解液于小瓶中，于真空中脱酸抽干，加1.00 mL 水再抽干，再加1.00 mL 水再抽干，准确加入1.00 mL 0.02 mol/L 的盐酸溶液，充分溶解备用。

精密量取上述溶液500.00 μL，置于5 mL 塑料离心管中，精密加入1 mol/L 三乙胺乙腈溶液250.00 μL，混匀，精密加入0.10 mol/L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液250 μL，混匀，室温（25℃）放置1 h，加2.00 mL 正己烷，剧烈振摇，放置10 min，取下层溶液用0.22 μm 的水相膜滤膜过滤待用。

色谱条件：色谱柱C18（4.6×250 mm×5 μm）；流动相A 0.10 mol/L 乙酸钠-乙腈（97 ∶3）（用乙酸调节pH 6.50）；流动相B 乙腈-水（4 ∶1）；流速1.0 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL；检测波长254 nm。

1.3.7 金属离子含量的测定

标准溶液的配置：吸取铁、铜标准溶液，用5%HNO3将标准溶液稀释成20 mg/L 的储备液，取20 mg/L的储备液再次稀释为200、400 μg/L 的储备液，取200、400 μg/L 储备液适量依次配制成0、8、16、24、32、48、64 μg/L 的系列标准溶液，摇匀待用。

前处理方法：称取1 mL 样品至聚四氟乙烯消解罐中，加入5.00 mL 硝酸。静置，反应结束后，密封，放入微波消解仪消解。

待温度冷却至50 ℃以下后，取出消解罐放入通风橱中，打开消解罐，用超纯水润洗，转移至50 mL 容量瓶中，至少润洗3 次~4 次，用超纯水稀释定容至刻度，待测。空白对照同法处理。将溶液过0.45 μm 水相滤膜后上机检测。

1.3.8 抗氧化能力的测定

DPPH 自由基清除率测定方法：参照文献[9]。分别取100、80、60、40、20 μL 酒样与10 mL 容量瓶中，定容。将不同浓度的酒样2 mL 与2 mL DPPH 乙醇溶液混匀，与暗处反应30 min，于517 nm 下测定吸光度值为A1。2 mL 水与2 mL DPPH 乙醇溶液混匀，测定吸光度值为A2。2 mL 不同酒样与2 mL 水混匀，测定吸光度值为A3。抗氧化清除自由基能力用半抑制浓度（IC50）表示，IC50越小，自由基清除能力越强。

ABTS+自由基清除率测定方法：参照文献[10]。分别取250、200、150、100、50 μL 酒样与10 mL 容量瓶中，定容。将不同浓度的酒样2 mL 与2 mL ABTS 反应液混匀，与暗处反应4 min，于734 nm 条件下测定吸光度值为A1，用蒸馏水代替酒样与ABTS 混匀测定吸光度值为A0。ABTS+自由基清除率/%=（A0-A1）/A0×100，并通过SPSS 计算IC50值。

羟自由基测定：按照羟自由基测定试剂盒中的说明方法进行测试。

总抗氧化能力测定：按照总抗氧能力测定试剂盒中的说明方法进行测试。标准曲线为：y =13.344x+0.045 7，R2=0.999 0。

2 结果与分析

2.1 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中VC 含量的变化

VC具有较强的抗氧化性，在·OH 清除能力方面作用突出，VC含量随发酵时间的变化如图1 所示。

图1 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中VC 含量变化Fig.1 Changes of VC during pineapple peel glutinous rice wine fermentation

在发酵前期，VC含量为0.70 g/L，随发酵时间增加，含量逐渐减少，至第6 天时，减少了0.24 g/L，可能是发酵初期，酵母需要有氧呼吸产热，导致温度较高，且有大量氧气存在导致VC氧化分解[11]。VC含量在6 d~10 d 时迅速增加，从0.46 g/L 增加至0.73 g/L，可能是随着发酵的进行，微生物分解菠萝皮渣，酒精度升高，VC得到浸提溶于酒液中。

2.2 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中黄酮、多酚含量的变化

图2 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中黄酮、多酚含量变化Fig.2 Changes of the flavone and polyphenol contents during the pineapple peel glutinous rice wine fermention

菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中黄酮、多酚含量变化见图2。多酚和黄酮含量对果酒的保健作用和品质有密切关系。如图2 所示，黄酮在发酵过程中呈先升后降的变化趋势。发酵前8 d 黄酮含量增加较快，从0.33 mg/L 升高至0.41 mg/L，这可能是菠萝皮渣中黄酮含量较多，随着发酵的进行，酒精度增加，黄酮浸提量增大[12]。多酚含量在发酵前6 d 降低0.03 g/L，6 d~15 d时迅速增加，由0.63 g/L 增加至0.70 g/L，在15 d~20 d 时多酚含量迅速降低至0.59 g/L，之后维持稳定。可能是发酵前期酵母代谢旺盛，产生大量有机酸与酚类物质结合、形成酚酸类物质，导致总酚含量减少，随着酒精度的升高和菠萝皮渣浸泡时间的延长，产生羟基类肉桂酸并形成酚类导致总酚含量升高，与文献[13]中多酚变化趋势一致。在发酵第15 天后黄酮、多酚含量都明显降低，可能是多酚类物质氧化聚合以及与蛋白质和其它细胞残余物结合和沉淀，有些酚类易受贮藏温度、含氧量及果实成分等因素的影响而分解[14]。

2.3 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中蛋白质含量的变化

菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中蛋白质含量变化如图3 所示。

研究表明发酵前期蛋白质含量迅速升高，由0.15 g/100 g 增加至0.24 g/100 g，可能是菠萝皮渣在纤维素酶和果胶酶的作用下分解，使蛋白质融入发酵醪中。在发酵8 d 后蛋白质含量缓慢上升，可能是糯米酒中蛋白质含量较高，慢慢融入发酵醪这与文献[15]报道中蛋白质变化趋势一致。可能是菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中加入氮源，使酵母在整个发酵过程中可吸收氮含量充足，而没有利用菠萝皮渣中蛋白质含量有关。而在贮藏后期蛋白质含量缓慢降低，可能是部分蛋白质与单宁类物质结合形成沉淀所致。

图3 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中蛋白质含量变化Fig.3 Changes of the protein during the pineapple peel glutinous rice wine fermenteion

2.4 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中糖含量的变化

菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中果糖、葡萄糖和蔗糖含量的变化结果见表1。

酵母发酵过程是将糖转化为酒精的过程，果酒中糖的浓度与发酵进程密切相关，发酵过程中酿酒酵母将葡萄糖可转化成2，3-丁二醇和乙酸乙酯，果糖降解为苯甲醇和苯乙醇等；蔗糖可促进辛酸乙酯、癸酸乙酯等的生成，使果酒甜香[16]。发酵醪采用白砂糖调整糖度，因此发酵初始蔗糖含量较高，蔗糖不断水解为葡萄糖和果糖，但由于酵母代谢较快，因此发酵醪果糖和葡萄糖并没有大量积累[17]，其中2 d~4 d 时蔗糖降低最快，从66.81 g/L 下降至0.24 g/L，至第25 天时蔗糖已被酵母利用完全。发酵过程中葡萄糖和果糖先降后升又降，前6 d，葡萄糖和果糖含量分别降低了55.86 g/L和38.74 g/L，第8 天葡萄糖和果糖含量增加，可能是加入的糯米酒糖含量较高所致。菠萝皮渣糯米果酒中葡萄糖和果糖含量到第60 天分别降低了56.09 g/L 和38.61 g/L，葡萄糖的消耗量大于果糖，与文献报道相一致，表明酵母对葡萄糖利用率高[18]。

表1 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中糖含量变化Table 1 Changes of the sugar during the pineapple peel glutinous rice wine fermenteion

2.5 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中氨基酸含量的变化

对菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中17 种氨基酸含量进行测定，结果见表2。

表2 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中氨基酸含量变化Table 2 Change of amino acids in pineapple peel glutinous rice wine during fermentation

酒中的氨基酸主要来源于原料和酵母菌体蛋白质的降解，在发酵过程中酵母几乎可利用所有的氨基酸形成高级醇、挥发酸和酯类物质。发酵初期氨基酸含量都增加，第6 天时增加了0.88 g/L，可能是酵母分解菠萝皮渣，使氨基酸溶出。随后氨基酸含量降低，第15 天总氨基酸含量为1.44 g/L，可能是发酵后期氮源和碳源缺乏，酵母开始利用氨基酸代谢繁殖。天冬氨酸脱氨在一些细菌作用下后降解，转化成2，3-丁二醇，第10 天后天冬氨酸含量降低了0.16 g/L，2，3-丁二醇含量升高为1.22%[19]；第6 天~第10 天后苏氨酸含量降低了0.05 g/L，使乙酸含量升高。胱氨酸和蛋氨酸呈先平稳后升又降又升的变化趋势，组氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸呈先升后降又升的变化趋势，缬氨酸呈先升后降又平稳的变化趋势，异亮氨酸呈先降后升的变化趋势，酵母利用异亮氨酸作为主要营养氮源而快速繁殖。发酵结束后脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、胱氨酸含量较高，都达0.20 g/L 以上，这些氨基酸呈甜味和鲜味，苦味的氨基酸含量较低，使菠萝皮渣糯米果酒入口鲜爽、口味甘甜柔和。在氨基酸中，L-缬氨酸，L-亮氨酸和L-苯丙氨酸分别通过Ehrlich 途径分解代谢产生异丁醇，异戊醇和2-苯乙醇。发酵结束后17 种氨基酸含量与发酵开始相比均有增加，第60 天时菠萝皮渣糯米果酒总氨基酸含量达2.78 g/L，赋予菠萝皮渣糯米果酒较高的营养价值。

2.6 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中金属离子含量的变化

菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中铁离子和铜离子含量的变化结果见表3。

表3 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程金属离子含量变化Table 3 Change of metal ion in pineapple peel glutinous rice wine during fermentation

果酒中含有丰富的矿物质，大多数可被人体所需，如Fe 和Cu 等微量元素。这些微量元素主要来源于原料和酿造设备，并随着发酵的进行参与酵母代谢。铁离子是细胞色素和过氧化物酶的重要组成成分，对果酒色泽具有主要影响，但过量铁离子的存在会加速酒中多酚类物质氧化，导致酒体浑浊。铜离子参与超氧化物歧化酶的组成，铜离子含量较高时会严重抑制酵母生长，使酒精度低，残糖量高[20]。在国家标准GB/T27588-2011《露酒》中规定，露酒中铁离子含量≤8.00 mg/L，铜离子含量≤1.00 mg/L，超标的果酒不允许上市销售，因此在发酵中应对铁离子和铜离子严格控制。在整个发酵过程中，铜离子含量变化较小，这与文献[21]报道结果一致，可能是酒体对铜离子吸附作用强有关。发酵前期铁离子含量逐渐减少，与第2 天相比，铁离子含量分别减少了588.32 mg/L，可能是发酵前期酵母代谢旺盛，铁离子被酵母吸收后沉降，排出[22]。在发酵后期，铁离子含量呈上升趋势，可能是沉淀中酵母自溶，使细胞壁和细胞质中金属离子溶出。菠萝皮渣糯米果酒发酵采用皮渣为原料，且在发酵后期对皮渣进行压榨，使酒脚中铁离子溶于酒中，导致铁离子升高，后期由于澄清剂的加入，使铁离子沉降而较少。发酵过程中铁、铜金属离子不断变化，陈酿60 d 时菠萝皮渣糯米果酒金属离子含量较低，分别为2.46 mg/L 和0.07 mg/L，远小于国标中铁、铜离子的限量，有利于果酒稳定。

2.7 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中抗氧化能力的变化

酚类、黄酮和VC等物质的含量和种类主导果酒抗氧化活性[23]，如图4、图5 所示。

图4 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中DPPH·和ABTS+自由基清除率变化Fig.4 Changes of the IC50 of DPPH·and ABTS+free radical scavenging rate in pineapple peel glutinous rice wine during fermentation

图5 菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中-OH 自由基清除率和总抗氧化能力的变化Fig.5 Changes of the IC50 of-OH free radical scavenging rate and the antioxidant capacity in pineapple peel glutinous rice wine during fermentation

菠萝皮渣糯米果酒发酵和陈酿过程中ABTS+·、DPPH·清除能力先下降后上升，总抗氧化能力呈先上升后下降，与黄酮和多酚含量变化趋势基本一致。羟自由基清除能力呈先降后升的变化，在第4 天达到最低10.81 mg/mL，可能是前4 天VC和多酚含量都降低所致。从15 d 开始，菠萝皮渣糯米果酒抗氧化能力明显降低，陈酿60 d 时，菠萝皮渣糯米果酒中自由基清除能力IC50值分别为（19.33±0.38）、（34.00±0.01）、（12.54±0.13）mg/mL，总抗氧化能力为（5.95±0.12）U/mL，与发酵15 d 相比IC50值分别升高（6.36±0.06）、（5.39±2.26）、（1.46±0.05）mg/mL，总抗氧化能力降低了（2.22±0.15）U/mL，主要是15 d 后总酚、多酚和VC含量不断降低，使抗氧化能力不断减弱[24]。

3 结论

菠萝皮渣糯米果酒发酵过程中VC含量先降后升又降，第10 天达到最大，第60 天时降低了0.20 g/L；黄酮含量在前8 d 迅速增加至0.41 g/L，到第60 d 又降低为0.34 g/L，多酚含量在15 d～20 d 时迅速降低至0.59 g/L，之后维持稳定；至第4 天蛋白质含量增加至0.24 g/100 g，之后维持稳定，蔗糖在整个发酵过程中逐渐降低，而在菠萝皮渣糯米果酒中葡萄糖和果糖含量呈先降后升又降，第60 天时葡萄糖和果糖含量分别降低56.09 mg/L 和38.61 mg/L；在发酵结束后17 种氨基酸含量与发酵开始相比均有增加，除脯氨酸外，其他氨基酸均小于菠萝果汁中氨基酸含量，但较高的氨基酸含量使果酒具有较高的营养价值。铁、铜金属离子在发酵过程中不断变化，但发酵结束后金属离子含量较低，分别为2.46 和0.07 mg/L，远小于国标中铁、铜离子的限量，有利于果酒稳定。菠萝皮渣糯米果酒的DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力较强，IC50值分别为19.33 g/L 和34.00g/L。