复合酶法提取鲜玉米皮阿拉伯木聚糖的研究

马福敏，顾佳

（1.长春大学农产品深加工吉林省教育厅高校重点实验室，吉林长春130022；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AXs）的制备是研究其功能性质和广泛应用的前提。目前，产业化的AXs制备主要采用碱提技术，环境污染大，并且该法很容易破坏AXs 分子结构中的阿魏酸（ferulic acid，FA）等活性基团，使AXs 分子的生理活性损失很大[1]。生物技术特别是酶法提取技术则因其条件温和、绿色无污染、能最大限度地回收有效成分，代表了AXs 加工技术的发展方向。而酶法提取AXs 存在酶解产物复杂，分离纯化困难等问题[2]，需要对酶法提取进行深入的研究。

目前，应用酶技术分离AXs 主要集中在去除淀粉、蛋白等包裹纤维、降低分离纯化效率的成分[3]。张晓娜等[4]采用酶法提取麦麸皮中的AXs，并确定了最佳酶解工艺。然而，玉米皮中AXs 的分子上侧链的种类、数量、侧链的长度及取代方式较其他谷物中的复杂，且分子上连接阿魏酸、醋酸及羟基桂皮酸等活性基团，会使分子间发生更为复杂的氧化交联，致使酶分子不易与AXs 接触，降低酶解效率。目前，关于玉米皮酶法提取物的研究较少。

本研究采用木聚糖酶Amano HC 90 与纤维素酶Cellulase 复配，研究复合酶的比例、复合酶的添加量等对提取率和提取物中AXs 含量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲜玉米麸皮（鲜榨玉米汁副产物）：吉林天景食品有限公司。

D-（+）半乳糖、D-（+）木糖、D-（+）葡萄糖：美国Sigma 公司；阿洛糖：美国Miragen 公司；L-（+）-阿拉伯糖、D-（+）-甘露糖、L-（+）-鼠李糖：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；其他试剂均为分析纯。

木聚糖酶Amano HC 90（简称HC，由黑曲霉Aspergillus niger 菌株生产，酶活为87 240 U/g）：天野酶制剂（江苏）有限公司；纤维素酶Cellulase（由Aspergillus niger 菌株生产，酶活力为2 720 U/g）：美国Sigma 公司。

1.2 主要仪器

GC-14C 型气相色谱仪：日本Shimadzu 公司；HELEOSⅡ型高效体积排阻色谱（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）：美国Wyatt 公司；XT5618 型十二联平行发酵系统：汇能达生物工程设备有限公司；RE52C 型旋转蒸发仪：上海青浦沪西仪器厂；3K15 型高速冷冻离心机、Supelco 毛细管气相色谱柱：美国Sigma 公司。

2 试验方法

2.1 测定方法

2.1.1 鲜玉米麸皮的前处理

参照Hu YB 等的方法，略作改动[5]。

鲜玉米麸皮经自来水冲洗至水澄清，在电热鼓风干燥箱中，90 ℃烘干。将烘干的鲜玉米麸皮粉碎，过20 目筛网，并在121 ℃条件下高压灭菌20 min，于-20 ℃冰箱保存。

上述鲜玉米麸皮中加入0.05 mol/L，pH 值为6.5的磷酸缓冲液（1 ∶7，g/mL），室温（25 ℃）条件下溶胀18 h，放置水浴锅中，将温度调节至75 ℃，加入淀粉酶（10 μL/g 鲜玉米麸皮），搅拌反应1 h，将温度调节至60 ℃，加入高转化率糖化酶（4 μL/g 鲜玉米麸皮），搅拌下反应30 min，加入碱性蛋白酶（100 μL/g 鲜玉米麸皮），搅拌下反应4 h，100 ℃水浴中加热10 min 灭酶，以去离子水边冲洗边抽滤，至去离子水澄清，将滤渣放入鼓风干燥箱中，70 ℃条件下干燥12 h，即得去淀粉去蛋白质鲜玉米麸皮（destarched and deproteinised fresh maize bran，DSDPB）。4 ℃冷藏备用。

2.1.2 木聚糖酶活力测定

木聚糖酶活力测定方法按照文献方法并略作改动[5-6]。

以pH 4.5 醋酸-醋酸钠缓冲液配制1.0%（质量体积比）木聚糖底物溶液和稀释酶液。分别在试管中加入木聚糖溶液和待测酶液共3.5 mL，于50 ℃反应15 min，沸水浴中加热10 min 灭酶，冷却后，移取300 μL 于试管内，加入900 μL 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosa licylicocid，DNS）试剂，混匀，沸水浴5 min，冷却至室温（25 ℃）后在575 nm 条件下测吸光值。以每分钟催化木聚糖生成1 μmol 还原糖所需的酶量为1 个酶活力单位（U）。每个试验重复3 次。

2.1.3 纤维素酶活力的测定

纤维素酶活力的测定采用章绍兵[7]的方法，并略作改动。以钠为底物，加入一定浓度30 μL 的Cellulase纤维素酶，混匀，40 ℃条件下反应20 min，加入900 μL的DNS，沸水浴中加热5 min，540 nm，测吸光度值，绘制葡萄糖标准曲线。纤维素酶活力单位定义为：在40 ℃、pH 5.0 条件下，每分钟催化羧甲基纤维素钠生成1 μmol 还原糖所需的酶量（U），还原糖以葡萄糖表示。每个试验重复3 次。

2.1.4 阿拉伯木聚糖含量的测定

单糖组成测定按照文献的方法，并略作改动[8-9]。以β 阿洛糖为内标，4 μL 经还原、酯化及脱水处理的样品注入气相色谱仪中，经Supelco SP-2380 色谱柱（长30 m，内径0.25 mm，膜厚度0.2 μm）分离；载气：N2；检测器：氢火焰离子化检测器；进样温度和检测温度为280 ℃。AXs 含量为阿拉伯糖与木糖含量之和乘以0.88。每个试验重复3 次。

2.1.5 提取率的计算

提取率/%=100×提取物干重（g）/DSDPB 干重（g）

2.2 试验设计

2.2.1 工艺路线

酶法提取鲜玉米麸皮阿拉伯木聚糖酶工艺路线如图1 所示。

2.2.2 木聚糖酶与纤维素酶的复配

木聚糖酶与纤维素酶配合使用，可提高鲜玉米皮中AXs 的提取效率。本研究以提取率及提取物中AXs的含量为指标，确定木聚糖酶和纤维素酶的复配比例。

图1 酶法提取鲜玉米麸皮阿拉伯木聚糖工艺路线Fig.1 The extracting process route for arabinoxylan from fresh corn bran

木聚糖酶Amano HC 90 添加量的筛选：木聚糖酶添加量分别为50、100、400、550、700、850、1 000、1500、2 000 U/g 时，在pH4.8、温度为50 ℃的条件下提取4 h。

木聚糖酶与纤维素酶的复配：在两种酶的总添加量为1 500 U/g，木聚糖酶Amano HC 90 与纤维素酶的酶活比分别为200 ∶1、100 ∶1、50 ∶1、20 ∶1、10 ∶1、7.5 ∶1、5∶1 及1∶1 时，在pH4.8、温度为50℃的条件下提取4h。

3 结果与讨论

3.1 木聚糖酶的添加量对提取率和提取物中AXs 含量的影响

由于复合酶法提取鲜玉米麸皮AXs 中应以木聚糖酶提取为主，因此，本研究先确定木聚糖酶的最适添加量，结果如图2 所示。

由图2 可以看出，随着木聚糖酶Amano HC 90 添加量的增加，提取率和提取物中AXs 含量明显增加，当Amano HC 90 添加量增加到850 U/g 时，提取物中AXs 含量不断增加，此后不再增加，而提取率明显增加，当酶添加量为1 500 U/g 时，提取率最大，此后不再增加，因此，本研究确定酶的添加量为1 500 U/g 进行复合酶的添加量的筛选。

图2 木聚糖酶添加量对提取率及提取物中AXs 含量的影响Fig.2 The effect of Amano HC 90 dose on extraction yield and the AXs content in the extract

3.2 木聚糖酶与纤维素酶添加量之比对提取率和提取物中AXs 含量的影响

纤维素酶能够消化细胞壁β－葡聚糖并且打破AXs 与β-葡聚糖之间非共价键，释放更多AXs[10]。因此，使用纤维素酶与木聚糖酶复配，可大大提高AXs的提取率。本研究选取一种与木聚糖酶Amano HC 90作用条件较接近的食品工业用纤维素酶Cellulase 与之按不同比例复配，在加酶量为1 500 U/g 时，研究两者比例对提取率和提取物中AXs 含量的影响，结果如图3 所示。

图3 木聚糖酶与纤维素酶添加量之比对提取率及提取物中AXs含量的影响Fig.3 The effect of Amano HC 90 to Cellulase ratio on extraction yieldand the AXs contentin the extract

由图3 可以看出随着木聚糖酶与纤维素酶添加量之比的降低，提取率增大，而提取物中AXs 含量降低，综合考虑，选取木聚糖酶与纤维素酶添加量之比为10 ∶1（酶活比）。

3.3 复合酶加酶量对提取率和提取物中AXs 含量的影响

鲜玉米麸皮在pH4.8，提取温度为50 ℃，液料比为30 ∶1（mL/g），木聚糖酶与纤维素酶之比为10 ∶1（酶活比），加酶量分别为500、700、900、1 100、1 300、1 500、1 700 U/g 时，提取4 h，研究加酶量与提取率和提取物中AXs 含量之间的关系，结果如图4 所示。

图4 加酶量对提取率和提取物中AXs 含量的影响Fig.4 The double-enzyme dose on the extraction yield and the AXs contentin the extract

由图4 可以看出，提取率随加酶量的增加持续增大，而提取物中AXs 含量在加酶低于900 U/g 时，随加酶量的增加而提高，当加酶量高于900 U/g 时显著降低。这可能是由于当加酶量高于900 U/g 时，纤维素酶用量增加，鲜玉米皮中的纤维素被部分提取出来，导致提取物中AXs 含量降低。因此，本研究选取加酶量900 U/g。

4 结论

本研究对复合酶法提取鲜玉米皮中AXs 中复合酶的比例和添加量进行了研究。结果表明木聚糖酶与纤维素酶添加量之比为10 ∶1（酶活比），复合酶的添加量为900 U/g 时提取率和提取物中AXs 含量最高。经本研究所采用的复合酶提取玉米皮AXs，提取率可达35 %以上，提取物中AXs 含量可达70%左右。可优化此复合酶法提取工艺条件，进一步提高提取率同时提高提取物中AXs 含量，使复合酶法生产玉米皮AXs 成为高效、环保的提取方法。