不同发酵方式及发酵剂菌比对米发糕挥发性成分的影响

龚川杰，姜萌艺，李美伦，何利

（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

米发糕（fermented rice cake）是我国南方地区的传统发酵大米制品，成品表面光滑，内呈蜂窝状，无论冷热，均口感松软绵甜，有发酵所产生的特殊而令人愉快的风味物质，易被人体消化吸收[1-2]。四川地区的米发糕具有特殊的酒香和酸甜风味，其传统的生产方式是自然发酵或在新鲜米浆中接入老浆（前一天制作米发糕留下来的发酵好的米浆液）发酵[3]，产品的品质和生产操作控制主要依赖于制作者的经验与技能。此外，老浆不便保存及运输，不同的保存条件易导致其中复杂的微生物菌种比例和活性发生变化，进而影响后续发酵的米发糕质量，限制了米发糕的大规模生产。

风味物质的多少及和谐程度是判断米发糕品质的重要指标。研究表明，米发糕的风味和口感与米浆中酵母菌和乳酸菌的种类、菌种比例、加糖量、接种量、发酵时间和发酵温度密切相关[4-7]。目前的主要研究对象是湖南湖北地区[8-12]的米发糕，且关于不同地区的米发糕中主要挥发性成分与所占比重存在分歧[13-14]，尚未有对四川地区米发糕的研究。假丝酵母在食品发酵方面的研究与应用较少，可为米饭和酱油增香[15-17]。现已知酿酒酵母属对米发糕发酵过程中风味物质的形成起重要作用[13-14，18]，未见筛选出假丝酵母属为优势发酵菌属，以及其对米发糕风味物质影响的相关报道。本试验采用顶空固相微萃取-气质联用技术（headspace solid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS），对比四川省雅安地区市售老浆发酵、自然发酵及不同菌比人工接种发酵制作的米发糕挥发性风味成分种类及含量，结合其质构特性，考察不同发酵方式及发酵剂菌比对米发糕风味的影响，为复合发酵剂在米发糕实际发酵、生产中的进一步应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种：课题组前期从市售米发糕老浆中分离筛选、甘油管藏的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，编号为R2b），矮小假丝酵母（Candida humilis，编号为J1a）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，编号为J3a）。

培养基：MRS 培养基与麦芽汁培养基分别用于分离和培养米浆样品中的乳酸菌及酵母菌。培养基所用蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、磷酸氢二钾、柠檬酸二铵、乙酸钠、葡萄糖、吐温-80、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、琼脂、碳酸钙、麦芽浸出粉及氯霉素：均为分析纯，雅安市万科化学试剂公司。早籼米、白砂糖：食品级，市购。

表1 米发糕样品Table 1 Fermented rice cake samples

1.2 仪器与设备

JM-B20002 电子天平：余姚市纪铭称重校验设备有限公司；PTDG-32 型蒸锅：山东惠当家电器有限公司；JL-100 电动多用磨浆机：重庆市友吕机械制造有限责任公司；45 mm 硅胶马芬杯蛋糕模具：安琪酵母股份有限公司；60 目分样筛：雅安市万科化学试剂有限公司；TA-XT plus 型物性分析仪：英国Stable Micro systems 公司；7890A-5975C GC-MS 质谱联用仪、HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱：美国Agilent 公司；57330-U SPME 手动进样手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 57328-U 萃取头：美国Sigma 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 米发糕的制作

1.3.1.1 工艺流程

1.3.1.2 米浆的制作

早籼米在30 ℃下浸泡24 h，用磨浆机磨粉，米粉用60 目分样筛过筛，将过筛后的米粉与水按8 ∶2 的质量比混匀制得米浆。

1.3.1.3 自然发酵米发糕的制作

自制米浆在室温下（25 ℃左右）自然发酵8 h 制得发酵米浆，将发酵好的米浆定量盛入45 mm 硅胶马芬杯模具中，沸水蒸20 min，得到米发糕。

1.3.1.4 人工接种发酵米发糕的制作

将J1a、J3a 和R2b 分别在28 ℃和37 ℃活化24 h，按2 %的接种量接入液体培养基中，根据菌株的生长曲线，确定其对数生长末期（乳酸菌浓度达到108CFU/mL，酵母菌浓度达到107CFU/mL～108CFU/mL）为扩大培养时间，于恒温培养箱中进行扩大培养。扩大培养结束后，将新鲜菌液以4 000 r/min 离心30 min，用生理盐水（0.9%）洗涤后复悬，将乳酸菌与酵母菌以R2b ∶J1a ∶J3a=1 ∶6 ∶3、J1a ∶R2b=1 ∶9、J1a ∶R2b=9 ∶1、J3a ∶R2b=1 ∶9、J3a ∶R2b=9 ∶1 的体积比混合得到液态复合发酵剂，按感官评分得分最高的参数接入所有比例的液态复合发酵剂及白砂糖，即加糖量为米浆质量的20%，接种量为米浆质量的6 %，32 ℃下发酵8 h制得发酵米浆；同时按感官评分得分最低的参数接入菌种体积比为R2b ∶J1a ∶J3a=1 ∶6 ∶3 的液态复合发酵剂及白砂糖，即加糖量为米浆质量的10%，接种量为米浆质量的14%，32 ℃下发酵10 h 制得发酵米浆。蒸煮方法同上，制得米发糕。

1.3.2 米发糕中挥发性风味物质的测定

1.3.2.1 顶空固相微萃取法提取挥发性成分

精密量取米发糕样品5 g 移入20 mL 的顶空瓶中，用硅橡胶隔垫密封压紧，于60 ℃磁力搅拌器上加热平衡15 min 后，使用CAR/DVB/PDMS 三层复合萃取头顶空吸附40 min（一直保持60 ℃水浴），然后将萃取头插入质谱仪进样口，解析5 min，平行3 次。

1.3.2.2 气相色谱质谱分析

气相色谱条件：色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛细管柱；载气：氦气，纯度≥99.999%；柱流速：1 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样方式：萃取头在进样口解析5 min，脉冲无分流进样；柱温程序：起始温度40 ℃保持3 min，以4 ℃/min 升至150 ℃，再以10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min。

质谱条件：色谱-质谱接口温度：250 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度：150 ℃；离子化方式：电子电离源（electron ionization，EI）；电子能量：70 eV；质量范围35 AMU/s~350 AMU/s[19]。

1.3.2.3 挥发性成分定性分析

各组分质谱结果经NIST.11 谱库进行检索，根据相似度（surface ionization，SI）≥80 确认其香气成分，采用面积归一化法计算样品中各组分的相对含量。

1.3.3 数据处理与分析

应用Origin2016 进行作图，使用SPSS20.0（IBM 公司）做方差分析，差异的显著性水平为0.05。对不同发酵方式及不同菌比米发糕的挥发性物质进行主成分分析。

1.3.4 米发糕质构特性测定

采用P/36 R 探头对样品进行质构分析（texture profile analysis，TPA），参数设置：测定前速度5 mm/s，测定速度2 mm/s，测定后速度5 mm/s，应变位移60%，引发力5 g[20]。

2 结果与分析

2.1 米发糕样品截面图

样品1~9 的成品图见图1。

2.2 米发糕挥发性成分GC-MS 分析

样品1~9 的总离子流色谱图见图2。

不同菌比及发酵方式所得米发糕挥发性成分组成及相对含量见表2。

图1 米发糕样品1～9 截面图Fig.1 Cross-sectional views of fermented rice cake samples 1-9

图2 米发糕样品1～9 的总离子流图Fig.2 Total ion current maps of volatile components of fermented rice cake samples 1-9

表2 不同菌比及发酵方式所得米发糕挥发性成分组成及相对含量Table 2 The composition and content of volatile components of fermented rice cake obtained by different bacteria ratio and methods

续表2 不同菌比及发酵方式所得米发糕挥发性成分组成及相对含量Continue table 2 The composition and content of volatile components of fermented rice cake obtained by different bacteria ratio and methods

由表2 可知，9 种米发糕中共检出67 种挥发性成分，包括酯类30 种，醇类8 种，醛类8 种，酮类3 种，酸类5 种，酚类3 种，胺类1 种，烃类4 种，醚类1 种，杂环类3 种，含铅物质1 种。酯类、醇类、醛类、酸类化合物的种类多、相对含量高，其中酯类物质所占比重分别为44.423 7%、0.130 3%、0.791%、6.522 1%、6.791 3%、0.47%、1.623 3%、1.751 5%、0.612 3%。醛类所占比重分别为1.083 2 %、3.682 7 %、8.573 6 %、2.376 6 %、2.1609%、7.789 6%、7.573 9%、10.574 2%、11.601 4%。酯类和醛类物质往往具有花、果香气，对米发糕的挥发性成分呈正向贡献[21]。醇类所占比重分别为8.246 1%、19.312 1%、4.302 6%、28.868 1%、31.42%、33.005 8%、29.3856%、39.6775%、32.8382%。酸类所占比重分别为0、0、9.554 5%、1.951 8%、0.081 3%、4.478%、5.269%、0、4.708 3%。进一步证明酵母菌发酵产生的CO2和醇类物质等，能使产品质地蓬松，许多发酵食品如面包、果酒、啤酒、黄酒、干酪、酱油以及乌龙茶等都带有芬芳的香味，香味物质都是由酵母在发酵过程中自然形成[22]。乳酸菌在发酵过程中分泌的乳酸，可以使米发糕具独特而柔和的酸味。首次在四川地区的米发糕中检测出甲氧基苯肟，这在其他研究米发糕挥发性物质的文献中未见报道，具体形成原因还需进一步研究。

2.3 不同发酵方式及菌比对米发糕质构特性的影响

不同发酵方式及菌比对米发糕质构特性的影响见表3。

表3 不同菌比米发糕质构测定结果和感官评价结果Table 3 The result of TPA and sensory evaluation

根据表3 可知，9 种样品在回复性和内聚性上仅2号、5 号和9 号有显著性差异，在其他方面都有显著性差异（P＜0.05），因此选择硬度、弹性、胶着性和咀嚼性评价米发糕的质构品质。相关文献表明，米发糕的硬度、胶着性和咀嚼性与其品质呈负相关[23-26]。市售1、2号样品的弹性、内聚性、咀嚼性差异较大，硬度较其他样品而言较小，米发糕充分发酵，内部空隙细腻绵密，松软适中，是较为理想的产品。自然发酵由于未添加菌种，因此发酵不充分，产品过硬，弹性较小，胶着性和咀嚼性均较大，品质不佳。菌种体积比为R2b ∶J1a ∶J3a=1 ∶6 ∶3 在感官评价得分最高的正交条件下发酵制得的米发糕（样品5）硬度、胶着性和咀嚼性均最小，即使在最差的发酵条件下，硬度、胶着性和咀嚼性也明显小于其他样品，说明该复配菌比有利于菌株间的协同发酵作用，达到甚至超越了市售产品品质，可以改善米发糕的质构品质。

3 结论与讨论

不同生产方式生产的米发糕均含有苯甲醛和甲氧基苯肟，苯甲醛是具有苦杏仁气味的一种苷，甲氧基苯肟的报道较少，有研究认为黏细胞附着在柚子皮上生长发酵所得产物，因此甲氧基苯肟具有柚子果皮及果肉香[27]，也有研究认为是枣花蜜中的共有成分，是构成浓郁枣花香气的主要原因[28]；还有相关研究表明其为合欢叶、茎挥发油的主要化学成分[29]。除了自然发酵样品外，均含有苯乙醇，人工接种发酵的米发糕中苯乙醇含量明显高于市售米发糕。苯乙醇对香气的影响最大，具有新鲜的面包香，清甜的玫瑰样花香。市售米发糕成分种类差异非常大，含有多种酯，含量低，阈值高，香气值小于1，呈香物质较少。市售样品1 中含量最高的油酸甲酯无香味，与其他地区市售产品的主要成分不同，可能是由于四川地区米发糕的生产工艺与湖广地区不同，也可能是由于店铺的蒸笼蒸煮除米发糕以外的含油食物所致。自然发酵样品中乙酸含量最高，这与阳盈盈等[14]的检测结果一致，但产生的辛酸略有不愉快味，三甲胺具有鱼腥臭，姜黄烯有甜橙、姜和良姜的混合香气，略带辣、苦味[30]，对产品风味带来不良影响，且比容小，质构特性较差，产品质量不易控制。

矮小假丝酵母是一种公认安全的酵母[31]，其与乳酸菌存在一定的营养关系，二者常作为天然发酵剂广泛应用于面包、动物饲料、谷物等一些烘焙产品中[32]。接种J1a 与接种J3a 的双菌发酵剂相比，酸类物质的种类和含量显著增加，但酸类物质阈值一般较低，酸类物质过多会影响产品风味，带有酸腐味。在相同的酵母菌与乳酸菌菌比下，接种两种不同的酵母菌都产生了9 种共有成分，各自产生4 种～5 种特有成分，说明矮小假丝酵母与酿酒酵母对米发糕发酵产生的挥发性物质均有影响。

接种不同菌比发酵剂在相同条件和不同条件下发酵生产的米发糕中，三菌发酵产生的挥发性成分均在20 种以上，双菌发酵剂产生的挥发性成分种类在14 种左右，说明三菌混合发酵在双菌的基础上产生了许多新的风味物质。由酿酒酵母和植物乳杆菌复配的双菌发酵剂发酵制得的米发糕中苯乙醇（32.662 9%）和苯甲醛（10.039 6%）含量尤其高，这与相关研究中提出的主要挥发性成分为正戊醇[14]存在分歧。菌种体积比为R2b ∶J1a ∶J3a=1 ∶6 ∶3 在感官评价得分最高的条件下发酵制得的米发糕香气成分纯正、浓郁，含有其他杂质成分气味少，优化发酵工艺后可以提高米发糕的品质。

通过测量与分析不同发酵方式及发酵剂菌比制备的米发糕样品的挥发性成分及质构特性，得米发糕的主要芳香性成分为苯乙醇、甲氧基苯基肟，且接种发酵剂制作的样品中二者的含量比市售样品大大增多，在四川地区米发糕中检测出的特征性物质甲氧基苯肟与醇、醛、酯、酸共同形成米发糕特有香气。接入菌种体积比为R2b ∶J1a ∶J3a=1 ∶6 ∶3 的液态复合发酵剂在加糖量为米浆质量的20%，接种量为米浆质量的6%，32 ℃下发酵8 h 制得发酵米浆蒸制出的米发糕挥发性成分最丰富，总量较高，且富有弹性和韧性，内部的气孔大小均匀，孔壁厚薄均一，外观膨松饱满，感官品质好，整体品质优于市售产品和自然发酵产品。基于以上研究，植物乳杆菌、酿酒酵母菌及矮小假丝酵母菌作为复合发酵剂可用于米发糕的生产，能解决自然发酵与老浆发酵所得产品存在的质量不稳定、卫生不可控等问题，也可为其他发酵米制品的研究提供参考。