创伤性闭合性中型颅脑损伤动物模型的建立

钟旺旺 魏梁锋 陈伟强 李田飞 张灏 王守森

创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是由于外在机械力作用包括急性加速或减速运动、爆震波、高处坠落、碰撞及枪弹贯穿等所引起的颅脑损伤。在发达国家中，TBI是造成青少年死亡、残疾的首要因素[1]。随着社会经济发展、公路交通畅通，TBI的发生率也逐年上升，其死亡率处于居高不下的态势[2]。马锦华等[3]对西安市多家医院在2014年全年收治的2025例颅脑损伤住院患者进行分析，发现颅脑损伤类型以闭合性为主，占78.52%。因此本研究拟建立闭合性中等程度脑损伤动物模型，以期为后续的颅脑损伤研究提供动物模型。

材料与方法

一、实验材料

实验动物：健康雄性SD大鼠（SPF级）80只，体质量320 g±20 g，购自福建医科大学动物实验中心。试剂和仪器：兔单克隆抗体β-APP[Y188]和小鼠单克隆抗体NF-L[DA2]，均购自美国Abcam公司，参照Marmarou模型制作自由落体损伤装置[4]。

二、实验方法

1.动物分组：将80只健康雄性SD大鼠平均分为4组，将不同损伤程度的TBI小鼠分为A、B、C组以及假手术（N）组。各组动物实验期间均饲养于联勤保障部队第九〇〇医院（原南京军区福州总医院）比较医学科，并给予充足的饲料和饮用水。

2.动物模型：以10%的水合氯醛溶液（30 mg/100 g）腹腔注射麻醉后，暴露冠状缝和人字缝之间的颅骨，用骨水泥使已消毒的垫片紧密贴于颅骨上方。参照Marmarou模型建立TBI模型，A、B、C组分别按拟定的打击高度（1.0、1.5、2.0 m）使450 g的钢棒自由下落撞击大鼠头部，撞击后立即移开大鼠，避免二次打击[4]。N组仅不作重物打击，其他操作同TBI组大鼠。建模成功后用电热毯维持大鼠肛温于36.5℃±0.5℃。

3.观察指标：采用大鼠改良神经功能缺损评分（modified neurological severity scores，mNSS）评分量表对各组大鼠在伤后1、3和7 d进行神经行为学损害程度评估，监测2周内死亡率[5]。伤后1 d时各组随机选取5只大鼠过量麻醉处死，行心脑灌注后完整取脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后制成蜡块，用于HE染色及免疫组织化学染色，观察病理形态学改变、β-APP和NF-L表达情况。

三、统计学分析

采用SPSS20.0统计学进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示。重复测量数据资料采用多组重复测量方差分析，组间均数比较采取方差分析进行检验，进一步两两比较采用LSD-t法。计数资料采用率（%）表示，组间比较采用Fisher确切概率法检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、各组大鼠TBI伤后一般状况

TBI致伤组（A、B、C组）中，大鼠伤后均出现短暂意识丧失、呼吸抑制、心跳加速且伴四肢抽搐、足弓反张，接着呼吸浅快、心率减缓减慢至恢复平稳，未能恢复自主呼吸的大鼠死亡。假手术组（N组）大鼠未出现上述症状。与假手术组比较，致伤组大鼠的意识恢复后，反应迟钝，主动活动减少；伤后14 d内N、A、B、C组的死亡率分别为0%、5%、20%、60%，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；A、B、C组大鼠颅骨骨折发生率依次为0%、5%、15%，各组间骨折率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

二、神经行为学改变

B、C组大鼠伤后1、3及7 d的mNSS评分均高于N组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组大鼠伤后1、3 d的mNSS评分明显高于N组（P＜0.05），伤后7 d的mNSS评分与N组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与B组比较，A、C组mNSS评分差异具有统计学意义（P＜0.05），详细信息见表1。

表1 各组大鼠伤后各时间点mNSS评分组间比较（）

表1 各组大鼠伤后各时间点mNSS评分组间比较（）

与N组比较，aP＜0.05；与A组比较，bP＜0.05；与B组比较，cP＜0.05

三、脑组织病理形态学检查

HE染色结果（图1）：N组，光镜下神经元及神经胶质细胞形态结构正常，胶质细胞和神经元未见明显的肿胀，血管周围间隙无增宽。TBI伤后24 h时A、B、C组均可见不同程度基质疏松，细胞周围间隙和血管周间隙轻度扩大，星形胶质细胞肿大，神经元核固缩、胞体收缩呈三角形，胞质嗜色性减弱，核皱缩浓染，细胞周围间隙和血管周围间隙较N组变宽。随致伤量的增加，神经细胞排列紊乱、变性程度加重。

免疫组织化学染色结果（图2）：N组大脑皮质、胼胝体区未见明显β-APP、NF-L表达，其余各组均可见β-APP、NF-L在神经元浆膜下和（或）轴突处积累，免疫组织化学染色呈棕染，随致伤量的增加，其阳性染色体神经元细胞数增加和表达强度增强。损伤后24 h，A、B、C组大脑皮质β-APP和NF-L表达程度逐渐增强。

讨论

TBI因其高发生率、致残率及致死率，社会医疗成本高，一直以来都是全球重点关注的严重的公共卫生安全问题之一。通过建立动物模型认识和了解TBI发生机制、病理生理演变过程，可以更好地提高医务工作者对TBI的研究水平，进而推动社会和医学的发展。目前研究较为广泛的TBI模型有液体冲击损伤模型、可控皮质撞击损伤模型、减速或加速撞击损伤模型、爆炸性损伤模型和瞬间旋转损伤模型等[4,6-10]。本文以Marmarou模型为基础，建立3组不同损伤程度的TBI，进而分析出中型TBI所需致伤量。

现已证实Marmarmou模型建立的TBI动物模型主要以弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury,DAI）为主，其病理特征在于脑组织受剪切力作用后轴索断裂损伤，轴索断端可呈圆柱状扩大和出现典型回缩球等变化。实验中大鼠TBI后HE染色可见大脑皮质不同程度基质疏松，细胞周围间隙和血管周间隙轻度扩大，星形胶质细胞肿大，神经元核固缩、胞体收缩呈三角形，胞质嗜色性减弱，核皱缩浓染，细胞周围间隙和血管周围间隙较假手术组变宽，即神经元细胞排列紊乱、变性程度随致伤量的增加而加重。HE染色未能明确显示出轴索断裂、损伤的形态，而β-APP染色可显示典型的轴索收缩球。β-APP是一种具有膜受体蛋白样的单跨膜蛋白，广泛存在于全身组织中，在正常状态下表达水平很低，可不被检出；而NF-L是构成NF的三个亚单位之一，分布于神经元的胞体和突起内，呈低磷酸化状态，伤后快速发生磷酸化、降解；TBI时，细胞骨架破坏、轴索断裂引起轴浆运输障碍，β-APP、NF-L异常聚集于轴索断端、阳性表达上调而被检出[11,12]。研究表明β-APP和NF-L在TBI后的表达程度与损伤程度呈正相关，即损伤程度越重，阳性表达越明显，而且表达水平在伤后早期即开始升高[13]。此外，其他研究同样发现β-APP、NF-L的表达程度与DAI损伤程度相关，而且具有较强的特异性和灵敏度，可作为DAI早期诊断标志物[14-16]。在法医鉴定过程中，颅脑标本β-APP、NF-L的表达与否、表达程度亦可帮助推断脑损伤发生时间及死亡时间[17]。本研究中TBI组中大鼠脑组织均可见病理形态学改变和β-APP、NF-L表达，且随着致伤量的增加，细胞形态学改变加重，β-APP、NF-L阳性表达水平增强，与文献报道基本一致。

图2 各组大鼠建模24 h后脑组织损伤区免疫组织化学染色（×400）

在TBI动物模型建立和应用研究中，尚缺乏统一的、与临床TBI患者GCS评分或GOS评分类似的量化评分系统，以评估动物TBI伤后损伤程度及预后评估，部分学者通过结合伤后大鼠血清中脑损伤标志物来评估脑损伤程度[18,19]。本研究通过分析比较各组大鼠伤后一般状况、神经行为学改变和脑组织病理改变推断出轻型、中型、重型TBI所对应致伤量，均可满足对脑损伤程度的评估。结果显示，在3种不同致伤量作用下，大鼠在一般状况、神经行为学改变和脑组织病理改变均有异常表现，且随着致伤量的增加，各观察指标损伤程度加重。在相同损伤程度组内，各组大鼠观察指标基本保持一致，具有较高的可重复性。A组伤后各时间点mNSS评分较低，恢复较快，脑组织病理改变程度较轻，DAI分子标志物（β-APP和NF-L）轻度表达；而B和C组伤后损伤程度相对较重，mNSS、脑组织形态学改变、β-APP和NF-L阳性表达程度等更加严重或明显；其中，B与C组间mNSS评分比较差异显著。此外，A组未出现死亡或骨折情况，而C组死亡率为60%，骨折发生率为15%，与文献中重型TBI动物损伤情况报道基本相符[4,20]。因此，A组定义为轻型TBI，因C组较B组更符合重型TBI，B组有一定的死亡率和骨折发生率，且介于轻型、重型TBI组之间，故而将B组定义为中型TBI更为准确。

综上所述，本研究通过选定合适的致伤量，控制大鼠死亡率、神经行为学缺损严重度、脑组织形态学改变程度，获得了满意的中型TBI动物模型，其可用于海上TBI损伤模型机制及其伤后病理生理变化的动态研究等，具有较重要的参考价值和意义。