微小RNA在心肌重构及心力衰竭中的作用

刘佳，孔一慧

心力衰竭（心衰，HF）严重威胁人类健康，2014年全球HF流行病学研究显示：发达国家HF患病率为1.5%～2.0%，我国HF患病率约1.5%[1]，快速准确识别HF患者非常重要。目前国内外指南已明确指出：N末端脑钠肽前体（NTproBNP）对HF具有相当高的诊断价值，但其易受多种因素影响，如：年龄、性别、肥胖、肾功不全等，单独检测易出现偏差，因此推荐NT-proBNP作为排除HF的指标[2,3]。微小RNA凭借切割靶mRNA或抑制靶基因翻译等重要作用受到广泛关注，现已证实心肌细胞中大多数miRNAs能在体液（血浆、尿液等）中检测到，且与机体的病理生理状态密切相关，可成为HF早期诊断、临床治疗及评估预后的新方法[4]。

1 微小核糖核酸（miRNAs）的合成及其生物学功能

miRNAs是一类在转录后调节介导基因表达的小的（长度约为22个核苷酸）内源性单链非编码RNA。首先在细胞核内RNA聚合酶Ⅱ作用下转录生成具有帽结构和多聚腺苷酸尾巴的初级miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA被核酸内切酶Drosha和RNA结合蛋白Pasha组成的复合物剪切成前提miRNA（pre-miRNA）；随后pre-miRNA在RNAGTP和Exportin-5的帮助下转移至胞浆，经Dicer酶作用剪切成miRNA双链结构，双链miRNA中一条生成成熟miRNA，另一条很快被降解；成熟miRNA整合到RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，通过与靶mRNA3＇非翻译区（3＇UTR）的碱基配对在转录后调节基因表达，导致翻译抑制或核糖核酸切割，发挥生物学作用[4,5]。

2008年首次在细胞外和循环血液中发现miRNAs，且这些miRNAs非常稳定；目前已在人类中鉴定出约4000个成熟miRNAs，调节30%以上的人类基因。每个miRNA调控多个不同的靶mRNA，且多种miRNAs是心脏发育阶段的重要调节因子，并在HF的发生发展中起重要作用（如重塑、肥大、凋亡和缺氧），外周循环miRNAs具备高稳定性及特异性，是HF更有潜力的生物标志物[5]。

2 miRNAs参与心肌重构过程的机制

心肌重构是HF发生发展的必经过程[2]。病理性心肌肥厚的发生涉及多种分子机制，主要包括：Ca2+依赖途径和PI3K/Akt途径。①Ca2+依赖性途径主要通过Ca2+/钙调素（CaM）依赖性钙调神经磷酸酶（CaN）和Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶（CaMK）来调节，CaN磷酸化激活活化的T细胞核因子（NFAT），随后转移到细胞核，与其他转录因子（如GATA4和MEF2a）相互作用，诱导肥厚基因表达；②胰岛素样生长因子-1（IGF-1）参与磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）/Akt途径，IGF-1和IGF-1受体（IGF-1R）结合磷酸化并激活胰岛素受体底物（IRS），激活的胰岛素受体底物激活PI3K和G蛋白Ras，PI3K激活Akt，然后激活哺乳动物雷帕霉素靶位（mTOR），抑制抗心肌肥厚因子糖原合酶激酶-3（GSK-3）和叉头盒-0类转录因子（FOXO），G蛋白Ras通过MAPK途径磷酸化多个转录因子促进心肌肥厚。多项研究表明：miRNAs在心肌肥厚中上调和下调,这些失调的miRNAs对心肌重塑产生积极或消极的调节作用。

3 心肌重构过程中涉及的miRNAs

3.1 抑制心肌肥厚的主要miRNAs

3.1.1 miRNA-1 miRNA-1是心肌重构过程中的关键miRNAs之一，在心脏内含量丰富，缺失该miRNA会导致严重的心脏缺陷。miRNA-1过度表达可防止心肌肥厚及HF[6]。研究发现[5]：对左心室肥大(压力过载诱导)的大鼠中注射miRNAs模拟物，使用表达miRNA-1的腺相关病毒（AAV9），导致心肌肥厚消退，纤维化及凋亡减少，钙信号改善，且效果持久，证明miRNA-1具有长期治疗病理性心脏重塑的潜力。Villar等[7]研究发现：病理情况下miRNA-1的表达与心肌细胞摄取脂肪酸的心脏型脂肪酸结合蛋白3（FABB3）的水平成反比，表明FABB3能确定心脏病患者的miRNAs表达水平。He等[8]研究发现：GTPase激活蛋白（SH3结构域）结合蛋白1（G3bp1）是一种内切核糖核酸酶，调节miRNA-1加工，G3bp1在心肌肥厚时上调，并通过结合miRNA-1-2i前干细胞环中的一致序列限制miRNA-1加工，减低miRNA-1靶标的表达；G3bp1介导的生长刺激抑制miRNA加工导致成熟miRNA-1减少，从而增加其靶位，这些靶位在心肌肥厚中起基础作用；肥厚心肌细胞中G3bp1的敲除能抑制miRNA-1下调和其靶位上调，并防止肥厚，说明G3bp1对心肌肥厚发展至关重要；综上表明：G3bp1转录后调节miNRA-1的加工，G3bp1介导的成熟miRNA-1下调是心肌肥厚的靶基因去表达和表达增加的必要条件。

3.1.2 miRNA-133 miRNA-133是一种成熟的肌源性miRNAs，在正常心肌细胞中高度表达。miRNA-133有两个变体（miRNA-133a及miRNA-133b），miRNA-133的突出功能是介导心肌肥厚、心肌细胞分化和相关心脏疾病；miRNA-133表达下调可诱导心肌肥厚基因表达，导致舒张期左室壁、室间隔厚度增加[9]。Kuiper等[10]在LBBB大动物模型隔膜和左室游离壁（LVfw）中测量miRNAs的表达水平，发现miRNAs的靶基因是结缔组织生长因子（CTGF）、血清反应因子（SRF）、活化T细胞的核因子（NFATc4），miRNA-133a通过抑制CTGF表达防止局部心肌肥厚，但与SRF和NFATc4无关[11]。miRNA-133a是去甲肾上腺素诱导心肌肥厚的重要调节因子，通过多靶点调节多种信号通路，具有负调节作用。Lee等[12]研究发现：miRNA-133a可通过新靶点PKCδ和Gq保护鼠心肌肥厚免受去甲肾上腺素刺激，这些都与α肾上腺素能受体的下游信号通路有关，说明miRNAs可通过调节多种信号通路成为治疗HF更有效的药物。虽然miRNA-133已被证明与HF的发病机制和进展有关，但其作用仍有争议，在肥厚心脏中发现到miRNA-133和钙调神经磷酸酶之间相互抑制，一旦钙调神经磷酸酶/NFAT信号被激活，miRNA-133的表达随钙调神经磷酸酶抑制的丧失而降低，导致心脏肥厚[13]。现已证明miRNA-133过表达对治疗心肌肥厚和纤维化有很高价值[14]。miRNA-133a过表达可预防糖尿病患者早期心脏纤维化。研究发现[15]：减弱miRNA-133a会促进糖尿病患者心肌肥厚，而miRNA-133a过表达可抑制心脏纤维化。Lim等[16]发现：环状核糖核酸环c8a1（Slc8a1）是心肌细胞miRNA-133a的内源性海绵，靶向螯合miRNA-133a，导致miRNA-133a上调，减轻心肌肥厚，Slc8a1可成为治疗HF的新靶点。此外miRNA-133也参与肿瘤的发生过程，如膀胱癌、前列腺癌和胃癌等[17]。

3.1.3 miRNA-378 过度心肌纤维化是心脏重塑和HF发生发展的主要病理过程，防止过度心肌纤维化尤为重要。Yuan等[18]研究证实，心脏成纤维细胞P38有丝分裂激活蛋白激酶（p38 MAPK）Smad2/3信号通路可促进心肌纤维化及心脏重塑，丝裂原活化蛋白激酶激酶6（MKK6）参与调节p38 MAPK磷酸化诱导的Smad2/3激活，MK6的3'UTR含有针对miRNA-378的靶序列，在压力超负荷诱导下miRNA-378通过直接靶向作用MKK6来抑制p38 MAPK磷酸化及Smad2/3信号通路，发挥抗纤维化及抗心脏重塑双重作用。机械应激后心肌细胞分泌miRNA-378，通过旁分泌机制抑制过度的心肌纤维化。有研究发现[19]：与miRNA-378过度表达的抗心肌肥厚作用相反，在代谢紊乱特别是在有心肌病时miRNA-378的治疗靶向性可能会产生有害的后果，应该谨慎进行。

3.1.4 MiRNA-185 miRNA-185通过负性调节Ca2+信号中的多个靶点发挥显著的抗心肌肥厚作用。一项基因研究[20]发现：Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶ⅱδ（CaMKIIδ）、钠/钙交换体1（Ncx1）和钙调神经磷酸酶依赖性3（Nfatc3）是miRNA-185参与肥厚过程的直接靶点，miRNA-185直接瞄准Camk2d、Ncx1和Nfatc3的3'UTR，有效阻断心肌肥厚信号，成为治疗HF等疾病的潜在药物靶点。

3.1.5 miRNA-155 miRNA-155是病理性心肌肥厚的诱导剂。Seok等[21]研究表明，AT丰富的交换域2（Jarid2）是miRNA-155的靶标，在压力诱导下miRNA-155能直接抑制Jarid2，促进心肌肥厚和HF的发展。也有研究发现[22]，miRNA-155通过下调血管紧张素Ⅱ受体亚型1（AGTR）和抑制AGTR激活的钙信号通路来改善心肌肥厚，且miRNA-155的缺失能阻止HF的进展。Fan等[23]研究发现，乳腺癌1型易感蛋白（BRCA1）失活能增加miRNA-155表达，导致心肌肥厚；多酚白藜芦醇（Rev）对部分下调miRNA-155有益，可成为治疗心肌肥厚的新策略。

3.2 促进心肌肥厚的主要miRNAs

3.2.1 miRNA-208 miRNA-208a过度表达能激活钙依赖磷酸酶信号通路及由心脏压力负荷介导的应激反应，导致心肌肥厚。一项对2 型糖尿病小鼠的心脏研究[24]发现：miRNA-208靶标是：肌球蛋白重链的快速亚型（α-MHC）、肌球蛋白重链的慢速亚型（β-MHC）、甲状腺激素受体-α（TR-α），心肌收缩力通过α-MHC与β-MHC的平衡维持，β-MHC上调是心脏重塑的标志之一，miRNA-208a通过一种TR-α机制增强β-MHC表达，糖尿病心脏中β-MHC表达增加是诱导心肌肥厚的开始；miRNA-208a由α-MHC基因的内含子编码，其表达依赖于α-MHC的表达，即使在α-MHC下调后，miRNA-208a仍持续表达，说明miRNA-208a上调先于结构重塑，激活的miRNA-208a诱导下游信号通路的改变，介导α/β-MHC亚型的转换最终导致心脏重塑；总之，miRNA-208a可作为糖尿病心肌重塑的早期分子调节剂。有研究发现[25]：miRNA-208a在血管紧张素Ⅱ诱导的自噬中起主要调节作用，自噬失调与心肌肥厚密切相关，促进心肌肥厚[26]。miRNA-208还通过性别决定区Y-box6（SOX6）的负调节参与心肌肥厚。

3.2.2 miRNA-212/132 miRNA-212/132簇在HF中都上调。miRNA-212是病理性心肌重构的重要调节因子，在压力诱导下主要是通过FOXO3介导的途径促进心肌重构[27]。慢性HF中，肾上腺素能激活的增加有助于结构重塑，miRNA-212/132簇在主动脉横向收缩后或α1-和β1-肾上腺素受体激活时上调，导致甲基CpG结合蛋白2（MeCP2）抑制，心肌细胞MeCP2的消融有助于可逆的主动脉横向收缩后衰竭心脏的恢复，将肾上腺素能激活与miRNA-MeCP2表观遗传联系起来，在HF的发展和恢复中发挥重要作用[28]。

3.2.3 miRNA-23a miRNA-23a属于基因间miRNA-23amiRNA-27a-miRNA-24-2簇的一部分[29]，Yang等[30]研究发现，miRNA-23a通过靶向介导溶血磷脂酸（LPA）诱导心肌肥厚，进一步明确LPA1是miRNA-23a的靶标，miRNA-23a通过LPA1参与靶向介导LPA诱导的心肌肥厚；敲除LPA3,反而消除了LPA诱导的miRNA-23a的升高，说明LPA1、LPA3在介导心肌肥厚中是相反亚型。miRNA-23a通过靶向抑制FOXO3a表达调节心肌细胞生长和凋亡，从而促进心肌重塑[31]。

3.2.4 miRNA-199b 研究发现[32]，miRNA-199b是钙调节神经磷酸酶/NFAT途径的直接靶基因，双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶1a（Dyrk1a）的3'UTR存在mirRNA-199b的靶序列，miRNA-199 b直接靶向下调Dyrk1a使钙调节神经磷酸酶/NFAT信号传导的敏感性增强从而介导病理性心肌肥厚及HF；该研究还通过特异性antagomir标准化Dyrk1a表达在体内抑制miRNA-199b，降低核NFAT活性，显著抑制甚至逆转心肌肥厚和纤维化，表明mirRNA-199b影响心肌细胞信号和基因表达，是HF的治疗靶点。

3.2.5 miRNA-22 现多项研究已证实：miRNA-22是应激诱导的心肌重塑的关键调节因子，在心肌和骨骼肌富集，Sirt1和Hdac4的3'UTR存在miRNA-22的靶点，Sirt1和Hdac4是两种对心脏功能至关重要的表观遗传调节剂，miRNA-22通过靶向抑制Sirt1和Hdac4，导致心肌肥厚和HF[33,34]。

3.3 其他miRNAs Verjans等[35]研究发现，在压力超负荷诱导下miRNA-221/222下调产生抗心肌纤维化作用而非肥厚性反应；可在体外抑制心肌重构，是HF治疗的新靶点。总之，HF患者miRNA-221/222水平降低与心肌间质纤维化和僵硬度增加相关。研究发现：miRNA-29通过调节PTEN/AKT/mTOR途径和抑制自噬而过度表达，促进心肌肥厚和HF[36]。

4 小结及展望

虽然目前很多miRNAs的转录调控机制已经明确，但它们在心肌重构的翻译和在HF中的潜在作用仍是未知，随着miRNAs与心肌重构、HF等相关研究的深入以及检测方法的成熟，外周循环miRNAs可为HF的诊断及预后评估打开新的窗口，并进一步促进以miRNAs为靶点治疗HF等相关疾病的新药物开发。