高效液相色谱法同时测定酱油中的8种生物胺

伍 蓥 续 颖 李逸纯 柯粤振

（广东美味鲜调味食品有限公司 广东中山 528437）

1 前言

生物胺是具有生物活性、含氨基的低分子质量有机化合物的总称，根据结构可分为3类：腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等脂肪族胺；酪胺、苯乙胺等芳香族胺；组胺、色胺等杂环胺。生物胺由原料中的酶或者微生物代谢产生的氨基酸脱羧酶作用产生，是生物活性细胞必不可少的组成部分，它们在调节核酸与蛋白质的合成及生物膜稳定性方面具有重要作用，但摄入过量会引起头痛、呼吸紊乱、血压变化、心悸等过敏性反应和症状，严重时可引起大脑内出血，甚至死亡。

生物胺广泛存在于食品中，尤其是酿造酱油、酒类等发酵食品中[1]，主要有8种：色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺，其中组胺与酪胺对人类健康影响最大[2]。酱油主要是由大豆/脱脂大豆、小麦、面粉及麸皮等多种原料在不同的微生物作用下发酵而成，且具有特殊色、香、味的液体调味品[3]。在酱油的发酵过程中，各种微生物在不同酶系作用下，与原料中各种有机物发生复杂的生物化学反应。其中，原料中富含的蛋白质在蛋白酶和肽酶的相继作用下，经一系列水解过程生成各种肽及氨基酸。由于含有相对较高含量的氨基酸以及多种微生物，因此酱油在长期发酵过程中很容易产生生物胺，导致酱油存在潜在的不安全性。有研究显示，在已检测过的酱油中普遍存在生物胺，有个别酱油中的总生物胺含量甚至超过了1 000 mg/kg[4-6]。酱油是我国以及亚洲广泛食用的液体调味品，在人们的日常饮食中占据着重要地位，对酱油整个发酵过程的中间产物即天然油中生物胺的含量和变化规律进行研究十分重要，因此，需要建立有效准确的酱油中生物胺的检测方法。

目前，检测生物胺含量的常用方法有：高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附法等，其中，最普遍的方法是高效液相色谱法。但不同研究中采用高效液相色谱法进行生物胺分析时，由于样品种类不同，设定的色谱条件也互不相同。因此，本文从流动相选择、梯度洗脱设置、柱温等对色谱条件进行探讨和优化，确立了同时测定8种生物胺含量的最佳高效液相色谱法色谱条件，以满足酱油中8种生物胺含量测定的要求。

2 试验部分

2.1 仪器与试剂

仪器：高效液相-紫外检测器；涡旋振荡器；水浴锅；氮吹仪；天平：感量为0.000 1 g；超纯水仪。

试剂：组胺盐酸盐；β-苯乙胺盐酸盐；酪胺盐酸盐；腐胺盐酸盐；尸胺盐酸盐；色胺盐酸盐；精胺盐酸盐；亚精胺盐酸盐；1，7-二氨基庚烷；丹磺酰氯（纯度＞99%）；乙腈（色谱纯）；丙酮、乙醚、谷氨酸钠（色谱纯）；碳酸氢钠、氯化钠、氢氧化钠（分析纯）；盐酸（优级纯）。

2.2 试验过程

2.2.1 样品预处理

吸取1.0 mL酱油样品于50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度线。

2.2.2 样品衍生化

准确吸取1.0 mL稀释后的样液置于15 mL塑料离心管中，依次加入250 μL 1，7-二氨基庚烷内标溶液（100 mg/L）、1 mL 饱和碳酸氢钠溶液、100 μL 氢氧化钠溶液（1 mol/L）、1 mL丹磺酰氯衍生试剂，涡旋混匀1min后置于60℃恒温水浴锅中衍生15min。取出离心管后，分别向其中加入100 μL谷氨酸钠溶液，振荡混匀，在60℃恒温条件下反应15 min，取出冷却至室温，在每个离心管中加入1 mL超纯水，涡旋混合1 min，在40℃水浴下氮吹除去丙酮（样液约减少1 mL）。然后加入0.5 g氯化钠涡旋振荡至完全溶解，再向其中加入5 mL乙醚，涡旋振荡2 min，静置分层后，转移上层有机相(乙醚层)于15 mL试管中，下层（水相）再次进行萃取，合并2次乙醚萃取液，在40℃水浴下氮气吹干。加入1 mL乙腈振荡混匀，使残留物溶解，用0.22 μm 滤膜针头滤器过滤，待测。

2.2.3 标准曲线的制作

配制浓度为 1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L 的生物胺混合标准溶液，取1 mL含有不同浓度的生物胺混合标准溶液，置于10 mL具塞试管中，依次加入250 μL 1，7-二氨基庚烷内标溶液（100 mg/L），具体操作同2.2.2。

2.2.4 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（柱长250mm，柱内径4.6mm，柱填料粒径5 μm）；紫外检测波长：254 nm；进样量：20μL；柱温：30℃；流速：1mL/min。流动相 A：0.1mol/L乙酸铵；流动相 B：乙腈；梯度洗脱：0~5 min，40%A→30%A；5~15 min，30%A→0%A；15~25 min，0%A。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件及衍生化过程的选择

试验过程中分别选用了有机相乙腈和甲醇与乙酸铵、乙酸等溶液搭配使用来选择合适的流动相，试验结果显示，乙腈和乙酸铵搭配使用分离效果最好。试验选用了梯度洗脱缩短检测时间并消除酱油中复杂物质的干扰，同时观察到柱温变化时出峰顺序没有发生变化，但分析时间随柱温的升高而缩短。

由于酱油中氨基酸、糖类与生物胺等与丹磺酰氯参与衍生化反应的物质含量较高，容易导致衍生化反应不完全，通过试验确定，对样品稀释50倍后再进行测定，衍生化反应效果良好。

3.2 线性范围与检出限

在1~50 mg/L内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，8种生物胺相关系数（r）均大于0.999。选取加入低浓度的加标样品进行试验，通过标准偏差（SD）评估方法得到色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺的方法检出限分别为：4.1、4.8、3.6、9.0、3.8、1.6、8.4、8.1 mg/L。

3.3 精密度试验

取8种生物胺均为阳性的酱油作为样本，摇匀后分别吸取1.0 mL酱油样品于50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度线，进行6次平行试验，结果详见表1。

从表1可知，在生物胺含量测定平行试验中，色胺、β-苯乙胺、尸胺、组胺、亚精胺与精胺的平行试验结果变异系数（RSD）均小于5.3%，腐胺与酪胺的平行试验结果变异系数均小于3.8%，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[7]中平行测定结果的变异系数要求，本次平行试验结果符合精密度要求。

4 结论

本研究以0.1 mol/L乙酸铵和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，丹磺酰氯衍生，在35 min内使8种生物胺完全分离。该方法重复性好，可以准确测定酱油中不同浓度水平的8种生物胺含量，满足对酱油发酵过程生物胺含量变化的监测。