新型锌制剂对虹鳟生长及免疫功能的影响

樊 英，李 乐，于晓清，胡发文，李天保，叶海斌，刁 菁

( 山东省海洋生物研究院，山东省海水养殖病害防治重点实验室，山东 青岛 266104 )

锌是人和动物体内必需的微量元素，分布于不同的组织中[1-5]。纳米锌粒子是粒径为1～100 nm的颗粒，因其细微化的形态，作为添加剂使用时更易被接受和吸收，且效果更佳[6-9]。目前，锌或纳米锌的研究涉及医疗、卫生、运输、养殖等多个领域，就畜禽养殖业来说，已在仔猪[10-11]和肉仔鸡[12-14]饲养上取得良好效果。应用形式主要是不同形式锌离子或纳米氧化锌，如适量的纳米氧化锌能不同程度地促进仔鸡的生长发育，从不同方面影响仔鸡自身的功能[12-14]。同时，七水硫酸锌[3]、蛋氨酸锌[3]、甘氨酸锌[5]等不同状态锌离子的应用同样已取得显著效果，证实锌在水生动物生长中的重要性。

虹鳟(Oncorhynchusmykiss)属鲑形目、鲑科、大麻哈鱼属，现已成为分布国家最多、地区最广的养殖鱼类之一。在虹鳟养殖过程中多采用高密度集约化方式，条件性致病因素通常易引起鱼体损伤、感染、溃烂，进而导致其生长缓慢或产品价值的降低，因此提高虹鳟自身免疫力是亟待解决的问题。而抗生素的广泛使用或滥用不仅存在药物残留问题，还会使致病菌产生耐药性，进而影响产品的安全质量。目前，关于虹鳟饲料添加剂或免疫增强剂的研究已有报道，如壳聚糖[15]，可从不同方面影响动物自身状况。纳米锌和纳米锌多糖复合体在虹鳟养殖中的应用鲜见报道。笔者以虹鳟为试验对象，通过其非特异性免疫指标的变化来研究纳米锌和纳米锌多糖复合体对机体免疫功能产生的影响，旨在为虹鳟饲料添加剂或免疫增强剂的研制开发提供理论数据及参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用锌为纳米锌及纳米锌多糖复合体溶液(1000、3000 mg/kg)(南京精德豐新材料科技有限公司)，其中锌为纳米级锌元素，多糖来源于杏鲍菇(Pleurotuseryngii)，1000 mg/kg含锌187.5 mg、多糖187.5 mg，3000 mg/kg含锌562.5 mg、多糖562.5 mg。虹鳟取自青岛鲁海水产技术发展有限公司。试验饲料为鲑鳟苗种配合饲料(北京汉业科技有限公司)，其营养水平见表1。

表1 专用配合饲料基本营养成分含量(干物质基础) %Tab.1 Approximate composition levels of basal diets (dry basis)

1.2 虹鳟养殖条件

每个平行组试验鱼放养于80 cm×50 cm×60 cm的水族箱中，试验前用基础饲料喂养7 d，后续开始试验。试验过程中日换水50%，日投喂量为体质量的2%，投喂时间为10:00、18:00，根据摄食情况适当调整并饱食投喂。试验期间水温为(15.0±2.0) ℃，溶解氧水平为(7.0±0.5) mg/L。

1.3 试验方法及指标测定

选取平均体质量(120±3.0) g的虹鳟300尾，随机分成5组(每组3个平行，每个平行20尾)，分别按照1 μL/g分别进行鱼体尾部肌肉注射纳米锌及纳米锌多糖复合体(1000、3000 mg/kg)，试验周期为10 d。对照组注射相同体积的无菌生理盐水。饲喂试验结束后，称量虹鳟体质量(滤纸上静置30 s后进行)，计算虹鳟特定生长率。

特定生长率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

式中，m1为初始体质量(g)，m2为终末体质量(g)，t为试验时间(d)。

分别于注射1000、3000 mg/kg不同剂量的纳米锌和纳米锌多糖复合体后1、3、6、9 d取样，每个平行随机取3尾鱼，自尾静脉处采血。一部分加入装有肝素钠(50 IU/mL)的离心管中，置于4 ℃保存备用；一部分加入2 mL离心管后4 ℃放置6 h，5000 r/min离心15 min，取血清置于-20 ℃保存备用。

杀伤细胞检测[16]：取0.2 mL抗凝血和0.2 mL 2 g/L四唑硝基蓝(NBT)溶液(四唑硝基蓝用无菌生理盐水配制成2 g/L的水溶液，与等量0.067 mol/L pH 6.4磷酸盐缓冲液混合，现配现用)于试管中混匀，37 ℃温育30 min，中间振摇一次，移至室温下放置15 min，混匀，吸取1滴于载玻片上做成推片，立即吹干，经快速瑞氏—姬姆萨染色，油镜观察，细胞被染成深紫色或深蓝色为NBT阳性细胞。计录一个视野内NBT阳性细胞百分数。

白细胞吞噬能力的测定：取混合肝素钠的血液1滴于洁净凹玻片的凹孔内，滴加1滴已活化的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)菌液(5×108个/mL)，充分混匀；将凹玻片置于有湿纱布预温的带盖容器内，37 ℃温育30 min；2000 r/min离心10 min，吸取血浆与红细胞交界面的白细胞做血涂片，自然晾干；甲醇固定1 min，水冲洗后自然晾干；姬姆萨染色1 min，水冲洗后自然晾干；油镜下显微观察，随机计数100个多形核白细胞中吞噬有细菌的细胞数，即为吞噬百分率(%)。

血清杀菌能力的测定：将杀鲑气单胞菌(Aeromonassalraonicida)28 ℃培养24 h活化后，无菌生理盐水洗涤并调整细菌密度至1×106个/mL；取200 μL新鲜血清与等体积细菌悬液混合，28 ℃温育1 h；取细菌和血清混合物培养于大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)平板上，28 ℃下培养24 h后计算平板中菌落数；以0.9%NaCl 溶液菌落形成为对照，计算血清的杀菌百分率：

杀菌百分率/%=(1-n2/n1)×100%

式中，n1为对照平板中菌落数，n2为试验平板中菌落数。

血清中酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合成酶、过氧化氢酶活性，以及微量丙二醛浓度均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。酸性磷酸酶活性单位定义：每100 mL样品在30 min产生1 mg酚为1个酶活性单位(U)。超氧化物歧化酶活性单位定义：每毫升样品在1 mL反应液中超氧化物歧化酶抑制率达到50%时所对应的超氧化物歧化酶量为1个酶活性单位(U)。一氧化氮合成酶活性定义：在提供充足的底物的条件下一氧化氮合成酶每分钟产生1 nmol一氧化氮所需要的酶量为1个酶活性单位(U)。过氧化氢酶活性定义：每毫升血清每秒钟分解1 μmol的过氧化氢的量为1个活力单位(U)。微量丙二醛为过氧化脂质降解产物中的成分，间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度，浓度单位为nmol/mL。

1.4 攻毒感染试验

活化后的杀鲑气单胞菌经胰蛋白胨大豆肉汤培养基28 ℃培养24 h，用无菌生理盐水调整菌液密度为107cfu/mL。试验结束后，每组随机抽取10尾虹鳟进行攻毒试验，经肌肉注射0.1 mL杀鲑气单胞菌稀释液2次，对照组注射相同剂量的生理盐水，及时记录日死亡情况，7 d后结束感染试验并统计其累积死亡率。按下式计算：

累积死亡率/%=n2/n1×100%

式中，n1为初始鱼数量，n2为累积死亡鱼数量。

1.5 数据处理与统计分析

试验数据以平均值±标准误表示。采用SPSS 17.0对数据进行处理和分析，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 纳米锌和纳米锌多糖复合体对虹鳟生长性能的影响

试验结束后对虹鳟生长性能进行统计，试验组虹鳟特定生长率高于对照组，但差异不显著(P>0.05)(表2)，可能是由于注射试验研究时间较短，其生长优势未能体现。但也并非没有效果，试验结果显示，1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组的效果最好。

2.2 纳米锌和纳米锌多糖复合体对虹鳟血液杀伤细胞数量的影响

杀伤细胞变化可反映吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的水平和功能，是鱼类非特异性免疫指标中的重要因素之一。1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组的激活效果在第3 d最强，杀伤细胞百分数达到22.3%，其次是1000 mg/kg纳米锌在第6 d的促进效果(19.6%)，均显著高于对照组(P<0.05)(表3)；而3000 mg/kg纳米锌和纳米锌多糖复合体组对虹鳟血液杀伤细胞数量的促进效果相对较弱，但仍与对照组差异显著(P<0.05)；由试验结果可见，剂量与效果无正相关性。

2.3 纳米锌和纳米锌多糖复合体对虹鳟血液白细胞吞噬能力的影响

3000 mg/kg纳米锌组虹鳟白细胞吞噬能力第3 d达到最高，为27.36%(P<0.05)，随时间的延长呈降低趋势(表4)。3000 mg/kg纳米锌多糖复合体组在第6 d白细胞吞噬能力最高，达39.37%(P<0.05)。

2.4 纳米锌和纳米锌多糖复合体对虹鳟血清杀菌能力的影响

虹鳟血清杀菌百分率随给予剂量的增加而提高，3000 mg/kg组血清杀菌百分率均显著高于1000 mg/kg组(P<0.05)(表5)。3000 mg/kg纳米锌组血清杀菌百分率在第3 d达到最高，为19.4%。3000 mg/kg纳米锌多糖复合体组血清杀菌百分率在第6 d达到最高，为32.43%，与1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组间差异不显著(P>0.05)。

表2 纳米锌和纳米锌多糖复合体对虹鳟生长性能的影响(平均值±标准误)Tab.2 Effects of nano-zinc and nano-zinc-polysaccharide compound on growth performance of rainbow trout O. mykiss (mean±SE)

注：相同小写字母表示同列数据差异不显著(P>0.05).

Note: means with same superscripts in the same column are not significantly different (P>0.05).

表3 纳米锌及纳米锌多糖复合体对虹鳟NBT杀伤细胞的影响(平均值±标准误)Tab.3 Effects of nano-zinc and nano-zinc-polysaccharide compound on NBT levels of rainbow trout O. mykiss (mean±SE)

注：不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05)；不同大写字母代表同行数据差异显著(P<0.05)；相同大写字母表示同行数据差异不显著(P>0.05);下同.

Note: means with different small letter superscripts in the same column are significantly different (P<0.05); means with different capital letter superscripts in the same line are significantly different (P<0.05); means with same capital letter superscripts in the same line are not significantly different (P>0.05); et sequentia.

表4 纳米锌及纳米锌多糖复合体对虹鳟白细胞吞噬能力的影响(平均值±标准误)Tab.4 Effects of nano-zinc and nano-zinc-polysaccharide compound on leukocyte phagocytosis of rainbow trout O.mykiss (mean±SE)

表5 纳米锌及纳米锌多糖复合体对虹鳟血清杀菌能力的影响(平均值±标准误)Tab.5 Effects of nano-zinc and nano-zic-polysaccharide compound on serum bactericidal activity of rainbow trout O. mykiss (mean±SE)

2.5 纳米锌和纳米锌多糖复合体对虹鳟血清中非特异性免疫指标的影响

不同剂量的纳米锌和纳米锌多糖复合体对虹鳟血清非特异性免疫指标产生了影响。过氧化氢酶活性在第3 d达到最高(P<0.05)，为1000 mg/kg纳米锌和纳米锌多糖复合体组，1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组最高(26.39 U/mL)，但两组间差异不显著(P>0.05) (图1a)，第6、9 d活性稍有降低，但不明显。1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组超氧化物歧化酶在第6 d达到最高(29.91 U/mL)(P<0.05)，纳米锌组在试验期间变化小，且与对照组差异不显著(P>0.05)(图1b)。由图1a、c可见，超氧化物歧化酶活性越高，其微量丙二醛浓度越低，二者成反比；第6 d 1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组微量丙二醛浓度最低(3.19 nmol/mL)(P<0.05)；第3 d纳米锌多糖复合体组与纳米锌组、对照组差异显著(P<0.05)。在第3 d，1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组一氧化氮合成酶活性最高(43.38 U/mL)(P<0.05)，第6 d稍有降低；第6 d，1000 mg/kg纳米锌和纳米锌多糖复合体组的一氧化氮合成酶活性差异不显著(P>0.05)(图1d)。酸性磷酸酶活性最高值出现在第6 d的1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组，达201.4 U/L，但与3000 mg/kg组纳米锌多糖复合体组间差异不显著(P>0.05)(图1e)。

2.6 纳米锌和纳米锌多糖复合体对虹鳟抗病力的影响

纳米锌和纳米锌多糖复合体不同程度地提高了虹鳟的抗病力。对照组受致病菌杀鲑气单胞菌感染后，第2 d即出现死亡情况，7 d内累计死亡率高达73.3%；而试验组在感染后第4 d出现死亡情况，与对照组差异性均显著(P<0.05)；纳米锌多糖复合体组免疫增强效果相对纳米锌好，1000、3000 mg/kg纳米锌多糖复合体效果差异不显著(P>0.05)，7 d累计死亡率仅有30%，从感染过程上看，1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组免疫增强效果更好。

3 讨 论

3.1 锌需求对虹鳟机体的影响

锌元素在养殖动物生长过程中具有重要作用，饲料中锌缺乏会引发鱼类等养殖动物食欲减退、免疫功能低下等症状导致死亡率增高[17]。锌过量不但会增加饲料成本，影响钙、镁、铁等元素的吸收利用，还会引起养殖水体中锌含量的增加，进而影响鱼类等养殖动物的摄食、生长状况[18]。因此，饲料中锌的给予剂量是养殖动物健康生长、养殖环境优化良好的重要保障措施之一[12,19-21]。本研究中通过注射方法给予虹鳟不同剂量的纳米级锌，不同程度地促进了虹鳟特定生长率的提高，增强了虹鳟对致病菌杀鲑气单胞菌的抵抗能力；然而，大剂量锌的添加未见异常的负面效果，可能是机体在需求范围内通过呼吸、排泄等生理过程排出了多余的锌，Hardy等[22]已通过放射性同位素65Zn证明了这一现象。锌元素给予的不同形式可导致不同的吸收利用效率，本研究中锌元素以纳米级形式给予，给予量达到最小，提高了体内吸收、转化效率，促进机体生长。而且，研究中还涉及了免疫佐剂多糖，从试验结果看，纳米锌多糖复合体的作用效果明显比纳米锌好，多糖因其特有的结构和功能一方面提高外源添加剂对鱼体发生的促进作用，另一方面可从吸收代谢方面间接辅助机体对锌源的吸收利用，增强营养和非特异性免疫功能。

图1 纳米锌及纳米锌多糖复合体对虹鳟血清免疫指标的影响Fig.1 Effects of nano-zinc and nano-zinc-polysaccharide compound on serum immunity of rainbow trout O.mykiss

图2 杀鲑气单胞菌攻毒后7 d内虹鳟累积死亡率Fig.2 Cumulative mortality of rainbow trout O.mykiss infected with A.salraonicida within 7 days

3.2 锌对虹鳟血液杀伤细胞及细胞吞噬功能的影响

细胞免疫在免疫防御过程中发挥着重要作用。杀伤细胞是鱼类细胞免疫指标中的重要因素之一，通过血液中杀伤细胞数量可反映出吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的水平和功能。黄芪多糖可明显增加犬齿牙鲆(Paralichthysdentatus)血液中杀伤细胞百分数[23]；酵母多糖在短时间内同样可以增加鲤鱼(Cprinuscarpio)杀伤细胞阳性细胞数[16]。本研究中纳米锌和纳米锌多糖复合体组得到类似结果，各试验组均能促进杀伤细胞阳性细胞数增加，与对照组差异显著(P<0.05)，且注射剂量与促进效果之间无正相关性，这与试验对象、试验条件及管理等多因素有关，研究中白细胞的吞噬能力与杀伤细胞数量之间的差异也可能是这些外界因素造成的。

3.3 锌对虹鳟血清杀菌能力及非特异性免疫指标的影响

锌作为一种微量元素添加剂具有多重作用，不仅与机体清除自由基的能力、脂质过氧化反应强弱有关，而且与机体蛋白质、脂肪和碳水化合物等物质代谢紧密联系；作为磷酸酶等酶活性形式的必要辅助因子，锌亦可能参与维持酶结构稳定和促进酶活性形式转变的过程[24-25]；这些均与动物机体的健康水平和抗病力有关。因此，本研究中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、微量丙二醛、一氧化氮合成酶、酸性磷酸酶被用于评价外源纳米锌和纳米锌多糖复合体对虹鳟非特异性免疫功能的影响。结果表明，试验第3 d，1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组过氧化氢酶、一氧化氮合成酶活性达到最高，分别为26.39、43.38 U/mL；第6 d，超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶活性最高，分别为29.91 U/mL、201.4 U/L，微量丙二醛浓度最低，为3.19 nmol/mL。随着锌含量的增加及时间的延长，不同时间获得了不同的免疫效果，给予量、给予时间、免疫效果之间不存在正相关性。作为机体非特异性免疫指标之一的超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶之一，常用来评定外界刺激对机体非特异性免疫功能产生的影响，最优生长必需的微量元素水平也就是鱼类免疫力达到最佳状态的水平[26]。纳米锌组超氧化物歧化酶活性在本研究过程中未发生显著变化，与对照组无显著差异，这可能由于试验对象、试验条件的限制，虹鳟血清超氧化物歧化酶活性对纳米锌的给予量未达到敏感程度。而在多糖佐剂的促进下，1000 mg/kg纳米锌多糖组超氧化物歧化酶活性在第6 d达到最高，与其他试验组差异显著。Onderci等[27]研究表明，在饲料中添加锌可显著提高虹鳟的抗氧化功能，与本研究结果一致。Hidalgo等[28]还证实，饲料中缺乏锌，虹鳟肝超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性均显著降低，这说明锌对机体抗氧化能力的重要性，也表明超氧化物歧化酶和过氧化氢酶作为评价锌影响指标的正确性。谭丽娜[29]认为，锌影响水生动物抗氧化功能的主要原因可能为锌可参与构成铜—锌超氧化物歧化酶，还可以诱导合成金属硫蛋白而抵制自由基的损害。相关深入研究仍在进行。

在虹鳟养殖中，细菌感染是影响经济损失的重要因素之一，非特异性免疫功能的提高是保证养殖效益水平的关键。本研究中纳米锌和纳米锌多糖复合体的添加提高了虹鳟血清非特异性免疫功能，间接提高了虹鳟抗杀鲑气单胞菌感染的能力，推测锌在虹鳟养殖过程中参与机体免疫酶合成及活性调节、调控免疫力或代谢水平、影响氨基酸等营养元素，最终提高机体健康水平。

综上所述，锌是虹鳟生长和免疫功能达到最佳水平的必需微量元素之一。纳米锌和纳米锌多糖复合体可不同程度地增强虹鳟机体各免疫指标水平，达到提高免疫功能的效果，其中以1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组(含锌187.5 mg、多糖187.5 mg)免疫效果最佳。