高效液相色谱法测定顺气通腑合剂中芦荟大黄素的含量

殷生楠，李进冬，李智勤

（1.泰州市中医院；2.泰州市人民医院，江苏 泰州 225300）

顺气通腑合剂为医疗机构制剂（批准文号：苏药制字Z0400181866），处方组成：生大黄、党参、白术、土茯苓、木香等多味中药。功效：益气健脾，顺气通腑，降气排气，促进肠蠕动。在治疗各种腹部手术后腹胀、腑气不通方面具有较好的疗效。目前，顺气通腑合剂质量控制仅为装量、PH、微生物、相对密度等通则检查项，而对于药性较强的大黄并未要求含量测定，不便较好控制合剂质量。处方中君药大黄具有泻下攻积，清热解毒，逐淤通经等功效[1]，研究表明[2]，大黄蒽醌类成分具有一定的肝损伤、肾损伤、肠毒性。芦荟大黄素作为大黄蒽醌类主要成分之一，其质量研究并不多见，根据文献报道[3]，芦荟大黄素易溶于甲醇中，所以本研究中采用甲醇作为提取溶剂。本文旨在建立顺气通腑合剂中芦荟大黄素的含量测定方法，用以控制顺气通腑合剂的质量，保证制剂的安全性及稳定性，为顺气通腑合剂由医疗机构制剂转变为药厂产品提供理论基础。

1 试剂与仪器

L-2000系列高效液相色谱仪（日本日立公司）；色谱柱为GRACEC18(4.6mm×250mm，5μm)；KQ-250E型医用超声波清洗器（上海楚柏实验室设备有限公司）。ELl04电子天平购自梅特勒．托利多仪器上海有限公司。

顺气通腑合剂来源于泰州市中医院，20180705、20180807、20180902（批准文号：苏药制字Z0400181866）；芦荟大黄素对照品（110795-201710）购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯（上海凌峰化学试剂有限公司）；磷酸为色谱纯（徐州市科翔化学试剂有限责任公司），水为娃哈哈牌纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex-C18柱（5um，4.6mm×250mm），以甲醇-0.1%磷酸 溶液 （85：15）为色谱柱，检测波长254nm，柱温30℃，流速为1.0 ml/min，理论塔板数按芦荟大黄素峰计算应不低于3000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦荟大黄素5.08mg置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得对照品溶液备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取顺气通腑合剂2ml，置100 ml锥形瓶中，加8%盐酸溶液10ml，超声2min，再加三氯甲烷10ml，加热回流1h，放冷，置分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀、用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.3 阴性对照溶液的制备 按照顺气通腑合剂处方及制备工艺制备缺芦荟大黄素的阴性样品，按“2.2.2”项下制备阴性对照品溶液。

分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl入高效液相色谱仪测定。结果表明，阴性对照在芦荟大黄素保留时间处无干扰峰出现。色谱见图1。

图1 顺气通腑合剂 HPLC 色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液0、2、4、6、8、10 μl注入高效液相色谱仪，每个浓度平行测定3次。以峰面积（A）为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标（C），绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。结果为：芦荟大黄 素 A=37.224C+3.016，r=0.9999， 线 性 范 围1.705～34.104 μg/ml。

2.4.2 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，重复进样6次，计算芦荟大黄素色谱峰面积的RSD值分别为0.98%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取顺气通腑合剂（批号20180705）按“2.2.2”项下制备供试品溶液，在0、2、4、6、8、10、12、24 h 分别进样 10 μl，按“2.1”项下色谱条件测定，计算RSD值芦荟大黄素色谱峰面积的RSD均小于1.0%(n=8)。结果表明供试品溶液在24小时内结果稳定。

2.4.4 重复性试验 取顺气通腑合剂（批号20180705）按“2.2.2”项下平行制备5份供试品溶液，分别进样10μl，按“2.2.2”项下色谱条件测定，计算芦荟大黄素色谱峰面积的RSD值分别1.63%(n=5)，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收试验 取顺气通腑合剂500 μl，分别加入低、中、高3个质量浓度的对照品溶液，每一质量浓度取3份，按“2.2.2”项下色谱条件测定，据测得量和加入量计算加样回收率和RSD。芦荟大黄素回收率和RSD为100.7%(RSD=1.31%,n=9)。

2.5 样品含量测定 取三批顺气通腑合剂（批号20180705、20180807、20180902）每批各三份。精密量取1 ml，按“2.2.2”项下制备供试品溶液。按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积。采用外标两点法计算顺气通腑合剂中芦荟大黄素的含量，结果见表1。

表1 顺气通腑合剂中芦荟大黄素测定结果（质量分数/mg·ml-1，n=3）

3 讨论

顺气通腑合剂是临床疗效确切的医院制剂，处方中大黄为主药，而芦荟大黄素是其中的主要蒽醌类成分。有报道指出[4]，大黄提取物虽有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄等功效，但随着其剂量的增加对肝、肾、肠具有一定毒性。为进一步提高制剂的质量，保证患者的用药有效安全，笔者建立了测定制剂中芦荟大黄素的质量控制方法，采用HPLC法对顺气通腑合剂中芦荟大黄素进行含量测定，提高了医院制剂的质量控制标准。

大黄中芦荟大黄素的测定方法有报道过，但在医院制剂中检测芦荟大黄素尚无报道。本实验采用对照品溶液在200～400 nm波长扫描，同时参考文献报道方法[5,6]，最终在254 nm波长下检测芦荟大黄素。把对照品存放于4℃冰箱中，分别在0、2、4、8、12、24 h测同一浓度样品的吸收面积，芦荟大黄素RSD均小于1.0%，表明对照品溶液在24 h内基本稳定。对同一批号的顺气通腑合剂平行测定6次，测其吸收面积，芦荟大黄素的相对标准偏差为1.26%，表明此方法能够重复操作。

实验结果表明，通过建立芦荟大黄素成分的高效液相色谱测定方法，明确了顺气通腑合剂的检测项目，可较为稳定地测定制剂含量，从而更好地控制制剂质量。本法快速、准确、灵敏度高、重复性高，可用于实际生产和医药制剂的质量控制，有利于药品标准的升级完善。