乳腺癌BRCA1、BRCA2基因突变的检测及临床意义

刘 明，潘宏刚，罗少龙

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，99%的患者为女性，乳腺癌细胞往往不具备正常细胞特性，细胞之间的连接较为松散，容易脱落，一旦脱落，游离形态下的癌细胞就会随血液或淋巴液向全身播散，出现转移，严重威胁患者生命[1]。乳腺癌包括散发性与遗传性两大类，遗传性乳腺癌与高显性乳腺癌易感基因缺陷有直接关系，在乳腺癌中占5%～10%[2]。BRCA1与BRCA2是最主要的两种乳腺癌易感基因，BRCA1位于染色体17q21，有22个编码外显子和2个非编码外显子，由1 863个氨基酸组成；BRCA2位于染色体13q12，有27个外显子，由3 418个氨基酸组成[3]。目前已检出的BRCA1/2致病性基因突变已达3 000多种，这些突变基因分布于整个编码区，并促进了截短蛋白的形成，导致BRCA1/2蛋白质功能丧失，进而导致BRCA1/2突变基因携带者的乳腺癌风险较普通人群有不同程度的增加[4]。本研究采用高通量基因测序法分析乳腺癌高危人群中的BRCA1/2突变基因携带情况，并评估其临床乳腺癌风险，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择200例乳腺癌高危女性作为研究对象。纳入标准：年龄40～75岁，有乳腺癌家族史者，未婚，所有研究对象均通过约谈、电话等方式了解其患癌家族史及生育、哺乳情况。其中40岁以下(不含40岁)45例，40～50岁56例，51～60岁42例，61～70岁38例，70岁以上19例。本研究得到了我院伦理委员会的批准，并且获得了所有参与者的知情同意书。

1.2 方法：检测所有研究对象的BRCA1/2基因，对家族性、早发性(40岁之前就被诊断出患有乳腺癌而没有乳腺癌家族史)以及三阴性乳腺癌患者的BRCA1和BRCA2的整个编码区和外显子区进行筛查，其余分散的乳腺癌患者接受BRCA突变筛查。所有片段均采用BigDye Terminator Cycle Sequencing 试剂盒和ABI 3730自动测序仪(CA)进行测序。根据检测结果对研究群体进行分类。同时比较检测结果与乳腺癌筛查结果的一致性。

1.2.1 DNA提取：按照DNA提取试剂盒的操作说明提取所有研究对象的DNA，采用紫外分光光度计测定DNA的浓度与纯度，-20℃冰箱内保存。

1.2.2 PCR扩增：参照文献[5]，设计BRCA1第2号、10号、18号、20号外显子及BRCA2第10号和第11号外显子的DNA序列引物，对BRCA1与BRCA2基因全部编码区、内含子、外显子拼接区进行PCR扩增。

PCR 扩增反应体系：总反应体系30 μl，内含DNA样品0.6 μg，10 mmol/L dNTP Mix 0.6 μl；10×Pfu缓冲液3 μl；Pfu聚合酶2.5 U/μl；上下游引物(10 μM)各0.6 μl，最终浓度0.33 μmol/L，ddH2O2补足反应体积至30 μl。

PCR 扩增反应条件：95 ℃下预变性5 min，95 ℃下变性30 s，57 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸60 s，完成40个循环后72 ℃下延伸5 min，4 ℃环境下保存，电泳鉴定。

1.2.3 测序与数据分析：采用ABI 3730自动测序仪进行测序。采用DANAMAN 6.0软件进行序列比对，采用Chromas Pro 2.33进行图谱比对，核酸序列编码参考NCBI序列BRCA1与BRCA2进行比对。突变位点根据NCBI dbSNP与BIC、ClinVar、Universal Mutation database(UMD)、HGMD进行比对，确定是否是新型突变。

1.3 观察指标：比较BRCA1/2基因突变携带者和非携带者乳腺癌诊断年龄的差异。通过比较在一级女性亲属未携带者中乳腺癌的发生率，评估在一级女性亲属中携带BRCA1/2突变的乳腺癌的相关性风险。

2 结果

2.1 BRCA1/2基因突变情况：共发现14例(7%)BRCA1/2的致病突变，其中BRCA1突变8个，BRCA2突变6个。6个(42.86%)BRCA突变为新型突变，未在乳腺癌信息核心数据库中报告过，见表1。

表1 BRCA1/2基因突变情况

2.2 BRCA1/2突变携带者与非携带者的年龄及家族乳腺癌发病率比较：BRCA1/2突变携带者相比非携带者，更有可能拥有乳腺癌家族史。本研究中的200名研究对象中，共获得了611位一级女性亲属的相关信息，其中48例携带BRCA1突变基因，40例携带BRCA2突变基因，523例不携带任何BRCA基因。BRCA1/2突变携带者的平均发病年龄为(44.5±7.21)岁，显著低于非BRCA1/2突变携带者的(51.4±6.39)岁(t=9.194，P<0.05)。且在这些亲属中23例发生了乳腺癌，BRCA1突变携带者、BRCA2突变携带者和非携带者的乳腺癌发病率分别为10.42%、12.50%和2.49%。BRCA1突变携带者与非携带者的风险比例(RR)=3.7,95%CI为2.34～6.09(P<0.05)；BRCA2突变携带者与非携带者的风险比例(RR)=4.42,95%CI为2.70～7.25(P<0.05)。BRCA(含BRCA1、BRCA2)突变携带者的女性一级亲属患乳腺癌的风险明显高于非携带者的亲属(χ2=16.389，P<0.05)，见表2。

表2 BRCA1/2突变携带者与非携带者的家族乳腺癌发病率比较

2.3 特殊年龄BRCA1/2突变携带者乳腺癌积累风险：BRCA 突变基因携带者40岁、50岁、60岁、70岁时的乳腺癌风险分别为1.7%、10.3%、28.4%、37.4%；其中BRCA1突变携带者分别为2.2%、9.9%、29.3%、37.9%；BRCA2突变携带者分别为1.2%、10.7%、27.2%、36.5%，见表3。

表3 特殊年龄BRCA1/2突变携带者乳腺癌积累风险

3 讨论

BRCA1与BRCA2均为抑癌基因，BRCA1于1990年发现，是一个位于染色体长臂17q12～21之间的基因，DNA全长100 kb，转录产物为7.8 kb mRNA，氨基端为锌指结构，主要功能为转录调控损伤诱导的相关基因，羧基端则有两个BRCT(乳腺癌易感基因羧基端结构域)，由95个氨基酸组成，其功能主要为DNA修复与调控细胞周期，中间则是一个NLS(核内定位信号区)，参与了蛋白质的核内转运。BRCA2是在1995年发现的另一个与遗传性乳腺-卵巢癌综合征相关的易感基因位点，全长约70 000 kb，组织特异性类似BRCA1，其功能主要在于修复双链DNA的损伤。BRCA基因参与了调控细胞周期、修复DNA损伤、基因转录与细胞凋亡等多种活动，是维持基因组稳定性的重要部分，若发生基因变异或缺失后，就会影响染色体稳定性，并引发恶变。BRCA1与BRCA2的基因突变会导致其蛋白质功能丧失，进而导致肿瘤发生[6]。这两个蛋白都具有Granin蛋白的某些特征。如果BRCA1/2基因的结构发生了某些改变，那么它所具有的抑制肿瘤发生的功能就会受影响。拥有这个基因突变的家族倾向于具有高乳腺癌发生率，通常发生在较年轻时，患者的两侧乳房都患癌，且同时患有卵巢癌[7]。

3.1 BRCA1/2突变情况分析：本研究共发现14例(7%)BRCA1/2的致病突变，其中BRCA1突变8个，BRCA2突变6个。6个(42.86%)BRCA突变为新型突变，未在乳腺癌信息核心数据库中报告过。到目前为止，人类BRCA1与BRCA2基因分别发现了1 800个和2 000个突变，包括内含子突变、错义突变、无义突变、移码突变等多种类型，这些突变往往会发生在RING与BRCT结构域中，而这些结构域又是BRCA1修复DNA的关键结构域。BRCA2蛋白的无义突变则主要发生在DNA结合域上BRCA1蛋白中，其中，无义突变与移码突变具有高致病性，占总体致病性突变的70%左右，并且会以常染色体显性遗传的方式遗传给子代。正常人群中，BRCA突变率不超过0.5%，整个乳腺癌人群中，BRCA基因突变携带者约为3%，但在家族性乳腺癌、早发性乳腺癌、三阴性乳腺癌、双侧乳腺癌等高危人群中突变率约10%，本研究纳入了高危人群，检测结果高于正常人群，但低于10%。一般情况下，BRCA1突变率要低于BRCA2突变率，但三阴性乳腺癌BRCA1突变率要更高，本研究纳入三阴性乳腺癌后，BRCA1突变率超过了BRCA2突变率[8]。

研究显示，三阴性乳腺癌基因突变率要高于非三阴性患者[9]，本研究中纳入了三阴性患者，但并未做比较研究，未来，我们将对不同地区的特定人群展开更大规模、更大样本量的调查与筛查，以期对BRCA1/2基因突变乳腺癌以及其他恶性肿瘤的外显率做出更大规模的评估，为癌症的早期诊断和预防提供帮助。同时，结合现有数据，对乳腺癌基因突变而造成的发病进行分子病理学方面的研究，探究从BRCA基因突变到乳腺癌发病过程中的一系列分子机理，从而明确乳腺癌的遗传性致病过程；并且可以对BRCA基因突变产生的乳腺癌的耐药性机理进行研究，以期筛选出针对性强、治疗效果良好的乳腺癌抗癌药物，为临床治疗提供理论基础[10]。

3.2 BRCA1/2基因突变携带者的乳腺癌患癌风险增量分析：本研究显示，BRCA 突变基因携带者40岁、50岁、60岁、70岁时的乳腺癌风险分别为1.7%、10.3%、28.4%、37.4%；其中BRCA1突变携带者分别为2.2%、9.9%、29.3%、37.9%；BRCA2突变携带者分别为1.2%、10.7%、27.2%、36.5%，BRCA1/2基因突变的个体乳腺癌风险显著高于正常人群。BRCA基因突变携带者患乳腺癌的风险与年龄的增长呈正相关，说明在年龄增长的过程中BRCA基因突变会产生积累效应，从而导致乳腺癌患病风险增加。有报道显示，到70岁时，BRCA1基因致病性突变者乳腺癌发生风险可达60%～80%，BRCA2可达40%～60%[11]。本研究获得的数据要低于这一数据，其原因可能在于对基因突变的良性多态性与有害致病性未做进一步区分，两类突变患者纳入同一个风险评估软件中同时进行评估，因此评估结果较低。本研究还显示，BRCA1/2突变携带者被诊断出患有乳腺癌明显比非携带者年轻(P<0.05)，BRCA1/2突变携带者的平均发病年龄为(44.5±7.21)岁，非BRCA1/2突变携带者为(51.4±6.39)岁，该研究与北京大学肿瘤医院乳腺中心的研究结果相似[12]。也有其他报道显示，45%的BRCA1/2基因突变携带者会在中位年龄45岁时发生乳腺癌，78%的携带者则会在中位年龄70岁时发生乳腺癌[13]。因此，建议将年龄小于45岁的乳腺癌患者作为BRCA1/2基因突变检测的适检人群。

3.3 BRCA1/2基因突变的家族性：本研究显示，BRCA1/2突变携带者相比非携带者，更有可能拥有乳腺癌家族史。本研究的200名研究对象中，共获得了611位一级女性亲属的相关信息，在这些亲属中23例发生了乳腺癌，BRCA1突变携带者、BRCA2突变携带者和非携带者的乳腺癌发病率分别为10.42%、12.50%和2.49%。BRCA1突变携带者与非携带者的风险比例(RR)=3.7,95%CI为2.34～6.09；BRCA1突变携带者与非携带者的风险比例(RR)=4.42,95%CI为2.70～7.25。BRCA突变携带者的女性一级亲属患乳腺癌的风险明显高于非携带者的亲属。有报道显示，家族性乳腺癌小于30岁的发生率约为2.6%，是散发性乳腺癌的1.91倍，家族性乳腺癌的低龄化与双线乳腺癌发生率均显著高于散发性乳腺癌，其中，家族性、遗传性乳腺癌中的三阴性乳腺癌患者携带有BRCA1/2突变基因的比例达到90%[14]。近年来，欧洲临床肿瘤协会(ESMO)、美国国立综合癌症网络(NCCN)均指出，乳腺癌相关基因突变携带者应该增强自检与乳房体检意识[15]，有明确家族性乳腺癌患者，可以在绝经前行预防性卵巢输卵管切除术，能够有效降低乳腺癌与卵巢癌患病风险。

综上分析，乳腺癌BRCA1、BRCA2基因突变有助于乳腺癌高危人群筛查，BRCA1、BRCA2基因突变携带者的乳腺癌发生风险要高于非携带者，乳腺癌相关基因突变携带者应该增强自检与乳房体检意识。