生物安全柜在医学实验室中的应用研究

赵艳争 天津市北辰医院 （天津 300400）

内容提要： 随着医疗水平的发展与进步，许多医院都建立了病原微生物实验室，以便为临床诊断和治疗提供及时和可靠的依据。病原微生物检测结果的解读和感染的判定是临床诊断重要依据，也是后期正确治疗的基础。在病原微生物提取的前几个步骤中，是必须直接接触病例的生物学样本的。该过程涉及加热和裂解。当检验人员打开样本容器时，含有病原微生物的气溶胶可能会散布到空气环境中。所以，在负压实验室的生物安全柜中操作更为安全。

生物安全柜通过将柜内的空气连续向外排出，可使柜内负压持续保持。空气由前窗操作口进入负压风道与柜体内空气充分混合后，进入静压箱，再通过高效过滤器处理后垂直向下，以单向层流的状态进入操作区，操作区三面墙体（除前窗玻璃外）均为负压风道，这样在外部环境和操作区之间形成了双层隔离（气幕隔离和箱体隔离）。而且操作区周围均为负压，保证不会泄漏样品，同时由于安全柜的气流方向是由外向内的，顶层设有高效过滤器，气溶胶不易溢出进入实验室，因此病原体提取等操作在生物安全柜内进行，可防止含有病原微生物的气溶胶在实验操作过程中逸出感染检验人员，对检验人员具有非常有效的防护效果。

1.生物安全柜的分类

生物安全柜在医疗器械分类中属于三类，而且生物安全柜分为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级[1]，以适用于不同的生物安全等级的微生物检测要求：

1.1 一级

通过设施的排气系统进行排气或使用生物制剂时，应保护环境和人员免受气溶胶的侵害，但不能保护产品免受污染。从外部排出的空气或房间再循环到实验室，排气中使用了HEPA过滤器。

1.2 二级

通过设施的排气系统正确通风以及处理生物制剂和危险药物时，保护产品，实验室人员和环境。HEPA过滤器用于外部排气或房间再循环，空气供应和排气中均使用HEPA过滤器。因此，它是应用最广泛的。根据入口气流速度和排风循环方式，二级生物安全柜可分为A1、A2、B1、B2四级[2]。

1.2.1 在A1安全柜中，通过工作台开口面吸入口的最小平均风速保持在0.38m/s；经过高效过滤器处理后垂直向下的气流，有七成是过滤的原有循环气体，有三成是新吸入经过过滤的补充气体，原有的循环气体有三成通过排气口高效过滤器过滤排放到实验室内。

1.2.2 A2安全柜中，通过工作台开口面吸入口的最小平均风速保持在0.5m/s；经过高效过滤器处理后垂直向下的气流，有七成是过滤的原有循环气体，有三成是新吸入经过过滤的补充气体，原有的循环气体有三成通过排气口高效过滤器过滤排放到室外，不再返回实验室内。

1.2.3 B1安全柜中，通过工作台开放表面吸入口的最小平均风速保持在0.5m/s；经过高效过滤器处理后垂直向下的气流，有三成是过滤的原有循环气体，有七成是新吸入经过过滤的补充气体，即原有的循环气体大部分都通过排气口高效过滤器过滤排放到室外，不再返回实验室内。所有被生物体污染的风管和静压箱应保持负压，或将负压风管和静压箱围起来。

1.2.4 B2安全柜中，通过工作台开放表面吸入口的最小平均风速保持在0.5m/s；经过高效过滤器处理后垂直向下的气流全部是新吸入经过过滤的气体，原有的循环气体全部通过排气口高效过滤器过滤排放到室外，不再返回实验室内。所有受污染的风管和静压箱应保持负压或是被直接排风的风道和静压箱包围。

1.3 三级

柜子通过手套与柜子相连，是完全气密式，为确保不受污染，测试产品需要通过双门分动箱进出；在处理风险时保护产品，实验室人员和环境，生物制剂等，通常配备双排气HEPA过滤器，HEPA过滤器放置在空气源中。安全柜适用于埃博拉病原微生物SARS相关实验等高风险场合[3]。

2.生物安全柜的安装使用

在进行病原微生物检测中，必须使用二级或二级以上的生物安全柜，并且在使用必须注意以下几点：

2.1 安全柜的使用必须严格按照要求进行操作，如使用前启动“消毒自净”，柜内物品合理摆放，定期维护验证等。生物安全柜一旦发生操作错误，泄漏或损坏，将无法保护操作人员。生物安全柜前的气幕非常脆弱，很容易受到干扰和污染。实验中，前窗位置不能随意打开，操作要轻柔，避免手臂频繁进出安全柜，防止干扰气流。安全柜在工作时，开关门，人员在室内走动，甚至在操作人员身后咳嗽，都会形成湍流，增加微生物气溶胶的溢出风险，造成实验室污染。许多污染事件都是由于实验人员违反操作规程、注意力不集中、操作动作不稳定、操作设备方法不当造成的。因此，在使用时必须牢固树立安全意识，养成良好的操作习惯，杜绝非法操作，严格执行病原微生物检测标准操作规程和生物安全操作规程，使用符合要求的实验室标准化设备。而且在检测操作中生物安全柜的管理非常重要，但往往被忽视，给实验室安全带来很大隐患。必须建立科学的管理制度，严格执行，确保使用安全。

2.2 现在仍有很多医院在使用医用洁净工作台，他们认为医用洁净工作台与生物安全柜外观相同，功能相似。事实上，生物安全柜和医用洁净工作台根本上是有很大区别的。在洁净工作台中空气通过高效过滤器净化后，垂直向下吹向操作区，从而保护样品不受污染。但由于操作区是正压状态，气流会向外溢出。它只保护样品，而不为操作者和环境提供保护。在病原微生物检测中将给操作者带来极大的隐患。生物安全柜为负压过滤式通风柜，可防止操作人员和环境接触实验室过程中产生的有害气溶胶。生物安全柜的正确操作可以完全保护操作人员、样品和工作环境。因此，在进行病原微生物检测时，应使用生物安全柜。而且，项目启动前应对实验室的微生物风险进行评估，评估合格后方可进行检测。

2.3 生物安全柜安装的位置选择不当也会造成污染

柜体的两侧和背面应保留30cm，并在柜体顶部保留30～34cm的空间。为了降低外部气流的干扰并确保生物安全柜的正常运行，应将生物安全柜的安装在远离实验室门窗，出入口及通道的位置，并避开供气口，以免对生物安全柜造成干扰。外部气流影响生物安全柜中的气流。放置生物安全柜的房间必须有足够的空气供应量。二级A2级的空气排量约为700～1200m3/h，而B2级的空气排量1000～1600m3/h。有一些型号的生物安全柜的空气排量会更高。所以在没有充足辅助空气供应的条件下，生物安全柜周围环境会变为高负压区域，并且也会影响生物安全柜的正常运行。

3.生物安全柜的校验

目前，对生物安全柜的定期检查和验证认识不足。很多人认为，只要生物安全柜能够转移，就可以继续使用。高效过滤器是生物安全柜的关键部件，具有使用寿命。使用一段时间后，细菌和灰尘在高效过滤器上积聚并造成损失，导致生物安全柜的空气流速、清洁度和负压降低。跌落不良等，如果生物安全柜的安全防护能力降低，检测样本、实验室环境和检验人员的安全无法得到保证，给实验室生物安全留下隐患。因此，必须定期对生物安全柜进行检查和验证。此外，需要注意的是，生物安全柜定期进行检查和验证，并要求有资质机构的专业人员对生物安全柜进行检查。并且具备以下条件：

3.1 专业可靠的，有资质认证的，首先需要有CMA资质认证

3.2 需要有生物安全柜检测资质能力，严格按照检测标准及项目指标要求检测，出具CMA检验报告。

3.3 检验报告格式规范，检测设备在校准有效期内并且参数齐全、量程适合、检测数值准确可靠。而且此检验检测机构为第三方独立机构，并且与安全柜制造商之间没有利益关系。

3.4 检测参数包括

（1）外观；（2）高效过滤器完整性；（3）报警及联锁系统；（4）气流方式；（5）进气流速；（6）下降流速。

检验应由健全资质的专业人员按照相关测试标准流程执行，以确定生物安全柜的运行性能和仪器状态，并依照国家相关标准判断是否符合要求。现场测试时，检测人员应穿戴好防护洁净服，并在生物安全柜彻底消毒清洁后进行测试[4]。

4.生物安全柜的保养维护

4.1 生物安全柜应定期进行保养维护，并注意以下几点：

4.1.1 维修人员必须配备生物防护设备，并经过相关生物安全防护知识专业培训，考核合格。

4.1.2 维修中通风风机不得开启。如特殊原因必须打开通风系统的，必须在经过甲醛熏蒸消毒后再开启，确认致病性生物危害已被有效杀灭，过滤器能得到有效控制病原微生物外溢扩散。

4.1.3 使用后的过滤器，一旦报废，必须在取出后严格灭菌后才能废弃。

4.2 操作人员在取得病原微生物检测资格证，并经过生物安全柜培训后方可进行病原微生物检测，但持证上岗后还应时刻保持警惕，避免病原微生物扩散事故发生。首先，使生物安全柜保持良好运行状态。因此检验人员应注意：

4.2.1 熟悉生物安全柜的工作原理，结构特点，性能参数、维护项目、相关生物安全知识等。

4.2.2 熟悉生物安全柜的运行状态，检查运行参数是否正常，上次检验和检验的时间、下次检验和检验的时间；更换过滤器等主要部件。

4.2.3 在每次运行前，都必须检查生物安全柜的运行状态。确认状态良好后方可使用。一旦异常，应立刻停机。

4.2.4 每次运行都应检查压差、风速等关键参数。如果生物安全柜的显示功能中没有压差、风速等参数，应使用手持风速仪进行检测，菌落总数应每季度进行测试。

4.2.5 有资质的专业人员才能进行过滤器的维护和更换。当风速经过调节仍低于目标参数时，必须更换高效过滤器，定期将粗滤器中的滤料取出进行清洗，并用手持风速仪测量实验室风速，确保风速达到使用要求。

5.使用生物安全柜的注意事项

在使用生物安全柜进行病原微生物检测时我们还发现一些问题如下：

5.1 在进行病原微生物检测时需要穿戴防护服，防护服较为宽松，当手臂进入生物安全柜的工作区域操作时，防护服的袖子容易堵塞进气格栅开口，而且生物安全柜内物品较多或者操作人员较多时，堵塞进气格栅气孔的风险就越大，这样会对生物安全柜的气流影响较大，当气流流速波动超过进入生物安全柜的空气流量标准值的±20%时，会降低生物安全柜的保护系数。所以应束缚袖口并注意对进气格栅开口的保护。

5.2 生物安全柜内物品不可过多，应尽量减少物品摆放，因为生物安全柜内气流由上而下，风速稳定，近似于单一的定向气流，单向气流的最大特点是气流中包含的污染物颗粒不受外界的干扰。颗粒的轨迹不会变化，轨迹是平行。但当在生物安全柜的操作区域放置物品时，气流模式会受到物体不规则表面的影响而改变[5]。这样，污染颗粒在气流中的平行轨迹被改变，从而在工作区域将出现不规则移动，从而增加交叉污染的风险。

5.3 操作时前窗开启高度一定要在度线内

前窗玻璃下边缘到台面前格栅的距离为前窗操作口的高度[6]。前窗操作口高度的变化直接影响到进风气流的流量，在前窗操作口形成负压屏障。从而隔离工作区在实验过程中产生的污染因素扩散到周围环境中，达到保护环境和检验人员安全的目的。流入气流的流量可以确定操作口的公称高度，并以生物安全柜的负压风量为准。工作端口的高度与流入气流的流速成反比。前窗开启高度过大，进风流速减小会破坏负压屏障气幕，污染因素会通过前窗开口在操作区域的扩散，危及环境和人员安全。前窗工作口过低时，会引起气流速度上升，波动值超过±0.025m/s（YY0569标准5.4.8.1的要求）。在生物安全柜的设计开发阶段，对操作口前窗开启高度的标称值进行了理论验证，在检验过程中通过微生物挑战实验（样本，检验人员和交叉污染防护）进行了验证。因此，操作口前窗开启高度必须保持在刻度线内。

5.4 检测过程中的操作区域位置尤为重要

在生物安全柜中检测样本时，样品是否得到良好的保护是影响检测结果的主要因素之一。如果将样本放在前窗开口的进气格栅上，就会受到影响，将失去洁净空气的保护。而且会污染进气格栅处的负压气流（颗粒物和微生物失去控制）。进气格栅是为保护工作区内产生的负压力而设计的。当样品放在进气格栅上方时，整个负压屏障气帘破裂。样品暴露在非受控区域时产生的污染因子不受控制。此外，在实验过程中，当操作人员进入生物安全柜前窗的开启区域时，会接触到生物危害，也会污染工作区内的洁净气流。检验人员可以通过玻璃前窗进行实验观察，玻璃前窗的隔离性能够保证生物安全柜内气流受控。

5.5 生物安全柜内进气口和生物安全柜顶的排气口绝对不能有物品遮挡，否则会破坏原有的风量平衡，倒置排风量下降，降低生物安全柜的保护系数[7]。

6.样本泄漏应急措施

在检测过程中一旦样本洒溅会造成病原微生物泄漏事故，所以泄漏响应措施尤为重要。

6.1 预留一个防漏工具包，可以随时解决泄漏问题

应仔细阅读的泄漏响应标准操作程序（SOP）摘要，实验室中的每个人都应阅读和理解，并配备适当干净的磨砂布，以及防止衣物污染的备用防化服。你还需要吸收性材料、消毒剂（10%次氯酸钠）、钳子或镊子来捡起破损的容器和杂物。

6.2 正确穿戴防护服

在生物安全柜中进行新冠核酸检检测之前，请确保正确穿戴防护服并在测试过程中始终穿着。不要脱下或打开衣领和袖口。此外，在处理培养、污染的表面或设备时，必须使用乳胶或丁腈手套。必须遵守相关的生物安全程序。

6.3 在机柜运行时执行去污步骤

当生物安全柜内有生物有害物质泄漏时，应立即开始清洗，柜内生物安全柜继续运行。生物安全柜应保持运行状态，防止空气污染物逸出，并确保柜内任何物品都留在柜内，以保护操作人员和实验室周围的人员的安全。

6.4 从溢出区域移除物品

在处理溢出物之前，首先移除可能含有溢出液体的试管、移液管和任何其他物品，然后将其放入柜中的生物危害容器中。重要的是要在操作柜中存放受污染的材料，以避免暴露在实验室中。为防止人身伤害，请始终使用钳子或镊子捡起玻璃和尖锐物体。

6.5 用吸收性材料覆盖溢出物

用吸收性材料（如纸巾）覆盖生物安全柜内的溢出物，并将其浸入水中。这有助于防止污染物的雾化。用毛巾盖住溢出物，从毛巾的外缘到毛巾的中间，在毛巾上涂抹合适的消毒剂。从外到内使用消毒剂，有助于将材料困在纸巾中并进行去污。重要的是要注意，溢出的药剂不能抵抗用于清洁的消毒剂。通过实验室程序解决您可能遇到的生物危害将确保您有适当的材料可用于泄漏。次氯酸钠溶液具有成本低、作用迅速、广谱有效等优点，但对生物安全柜内的不锈钢表面具有腐蚀性，应冲洗。（生物安全柜内使用氯化或卤素材料会损坏不锈钢）

6.6 允许20min的消毒剂接触时间

根据使用的消毒剂，消毒剂的反应时间可能需要改变。根据经验，20min应该足以中和污染物。

6.7 用毛巾擦掉溢出物和多余的液体

在溢出物被控制并且消毒剂有足够的时间反应后，用毛巾擦掉多余的液体。把用过的毛巾放在柜子里的生物危害袋里。

6.8 用清洁剂再次处理该区域

在溢出区域再次涂上消毒剂，并在适当的工作时间后用干净的毛巾擦拭。这有助于确保所有受污染的材料和表面都得到净化。如有必要，检查工作面下方的溢油盘，并遵循相同的消毒程序。

6.9 彻底冲洗溢流区

如果使用次氯酸钠（或任何其他腐蚀性消毒剂）清洁溢出物，用无菌水冲洗，然后从工作表面擦去剩余的漂白剂（或消毒剂）。次氯酸钠对不锈钢有很强的腐蚀性。如果用它来清洁生物安全柜，久而久之会造成损坏。

6.10 清洁机柜后，取下并妥善处理与污染物接触的手套和防护服

此外在完成每批次检测后应及时对生物安全柜内进行擦拭消毒，并对紫外灯进行清洁维护，然后开启紫外灯照射约15min。根据生物安全柜的使用情况还应进行定期清洁，尤其是需要洁净的关键位置进行清洁[8]，以保证生物安全柜的良好运行状态。