lncRNA KCNQ1OT1通过靶向miR-486-5p调控舌鳞癌CAL-27细胞的增殖和凋亡

张 娟，杨 晋，王 焱，高 杰,靳 昊,马素伟

(保定市第二中心医院 口腔科 ，河北 保定 072750)

舌鳞状细胞癌(Tongue squamous cell carcinoma，TSCC)简称舌鳞癌，是一种常见于颌面部恶性程度较高的肿瘤，复发和转移常导致其预后较差，死亡率高[1]。因此，加强对舌鳞癌发生机制的研究，寻找新型临床诊断标志物，对于做到早发现，早治疗具有重要意义。研究表明非编码RNA逐渐成为肿瘤研究中诊断和预后的新型生物学标记和靶向治疗策略[2]。lncRNA是非编码RNA的一种，研究报道lncRNA KCNQ1OT1在舌鳞癌中上调表达，与不良预后密切相关；敲低KCNQ1OT1可抑制癌细胞增殖[3]。KCNQ1OT1还调节舌鳞癌的顺铂耐药性[4]。KCNQ1OT1可促进神经母细胞瘤细胞凋亡[5]。而KCNQ1OT1对舌鳞癌细胞凋亡的影响及机制尚不清楚。生物信息学软件预测显示KCNQ1OT1与miR-486-5p有结合位点。研究报道肺鳞状细胞癌中miR-486-5p低表达，可作为其生物标记物[6]。miR-486-5p过表达可减少食管鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移，并诱导细胞凋亡[7]。而miR-486-5p对舌鳞癌细胞增殖、凋亡的影响及KCNQ1OT1是否通过调控miR-486-5p影响舌鳞癌还尚不清楚。因此，本实验旨在研究KCNQ1OT1是否通过调控miR-486-5p影响舌鳞癌增殖和凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2017年5月至2019年5月我院30例舌鳞癌患者的癌组织及癌旁组织标本，其中男16例，女14例，年龄17～69岁，平均(35.2±1.1)岁；所有患者均知情且同意。

1.2 细胞与试剂 舌鳞癌细胞CAL-27(货号：YS2197C，上海雅吉生物科技有限公司)；RPMI-1640培养基(货号：M0200，上海盈湾生物科技有限公司)；Trizol试剂(货号：5301100，杭州新景生物试剂开发有限公司)；反转录试剂盒(货号：RP1105-50T，上海吉至生化科技有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(货号：XY-TE-0731，上海烜雅生物科技有限公司)；MTT试剂盒(货号：8028，美国sciencell公司)；蛋白提取试剂盒(货号：CD-13559-ML，武汉纯度生物科技有限公司)；SDS-PAGE试剂盒(货号：FK-dy14572，上海延慕实业有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(货号：ZYS0185，上海泽叶生物科技有限公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：1548，上海信帆生物科技有限公司)；RIP试剂盒(货号：17-371，美国millipore公司)。

1.3 细胞培养及分组 取对数生长期舌鳞癌细胞CAL-27，将KCNQ1OT1抑制表达载体及其阴性对照、KCNQ1OT1过表达载体及其阴性对照、miR-486-5p模拟物及其阴性对照转染至CAL-27细胞中，分别记为si-NC组、si-KCNQ1OT1组、pcDNA组、pcDNA-KCNQ1OT1组、miR-NC组、miR-486-5p组；将KCNQ1OT1抑制表达载体分别与miR-486-5p抑制剂及其阴性对照共转染至对照转染至CAL-27细胞中，分别记为si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组、si-KCNQ1OT1+anti-miR-486-5p组。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测KCNQ1OT1和miR-486-5p的表达水平 提取总RNA，反转录成cDNA，按荧光定量PCR试剂盒说明进行反应，相对表达量用2-△△Ct法计算，△△Ct=(处理组Ct-内参Ct)-(对照组Ct-内参Ct)。KCNQ1OT1和miR-486-5p分别以GAPDH和U6为内参，KCNQ1OT1上游引物序列：5'-CTTTGCAGCAACCTCCTTGT-3'，下游引物序列：5'-TGGGGTGAGGGATCTGAA-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物序列：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；miR-486-5p上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列：5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；U6上游引物序列：5'-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGC-3'，下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 MTT检测细胞增殖 各组细胞分别培养24、48、72 h时，按试剂盒说明操作，用酶标仪检测450 nm处吸光度(OD)值。

1.6 蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，定量后进行SDS-PAGE、转膜、封闭，加入一抗4℃过夜，加入二抗室温培养1 h，加入化学发光试剂显影，成像后用Image J软件分析蛋白条带灰度水平，以GAPDH为内参计算蛋白表达水平。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞分别培养48 h，收集细胞按试剂盒说明操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 双荧光素酶报告实验检测KCNQ1OT1和miR-486-5p的靶向关系 构建KCNQ1OT1的野生型和突变型荧光素酶表达载体，将WT-KCNQ1OT1和MUT-KCNQ1OT1分别与miR-NC和miR-486-5p共转染至CAL-27细胞中，按照说明书检测荧光素酶活性。

1.9 RNA免疫沉淀(RIP)实验检测KCNQ1OT1和miR-486-5p的靶向关系 用RIP裂解细胞，准备免疫球蛋白G (IgG)和Argonaute-2 (Ago2)的磁珠，将加入RIP免疫沉淀缓冲液的细胞裂解产物加入到准备好的磁珠中，4℃旋转过夜，短暂离心后去上清，清洗6次，加入洗涤缓冲液、SDS及蛋白酶K，混匀后55℃孵育30 min，提取RNA，通过qRT-PCR方法检测Ago2复合体中KCNQ1OT1和miR-486-5p的富集水平。

2 结果

2.1 lncRNA KCNQ1OT1和miR-486-5p在舌鳞癌组织中的表达 与癌旁组织比较，舌鳞癌组织中KCNQ1OT1表达水平升高，miR-486-5p表达水平降低(P<0.05，见表1)。

表1 lncRNA KCNQ1OT1和miR-486-5p在舌鳞癌组织中的表达

2.2 抑制lncRNA KCNQ1OT1表达对舌鳞癌CAL-27细胞增殖的影响 与si-NC组比较，si-KCNQ1OT1组KCNQ1OT1表达水平降低，CAL-27细胞OD值降低，CyclinD1表达水平降低，p21表达水平升高(P<0.05)(见图1，表2)。

图1 增殖相关蛋白表达

表2 抑制lncRNA KCNQ1OT1表达对舌鳞癌CAL-27细胞增殖的影响

2.3 抑制lncRNA KCNQ1OT1表达对舌鳞癌CAL-27细胞凋亡的影响 与si-NC组比较，si-KCNQ1OT1组CAL-27细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高(P<0.05，见图2，表3)。

表3 抑制lncRNA KCNQ1OT1表达对舌鳞癌CAL-27细胞凋亡的影响

2.4 lncRNA KCNQ1OT1靶向调控miR-486-5p的表达(Starbase Predicted) Starbase预测显示KCNQ1OT1的序列中含有与miR-486-5p互补的核苷酸序列(见图3)。WT-KCNQ1OT1与miR-486-5p共转染后细胞荧光素酶活性降低(P<0.05，见表4)；RNA免疫沉淀实验结果显示，与Anti-IgG比较，使用Anti-Ago2后KCNQ1OT1和miR-486-5p的富集水平均升高(P<0.05，见表5)；与pcDNA组比较，pcDNA-KCNQ1OT1组miR-486-5p表达水平降低；与si-NC组比较，si-KCNQ1OT1组miR-486-5p表达水平升高(P<0.05，见表6)。

图3 KCNQ1OT1的序列中含有与miR-486-5p互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

表5 RNA免疫沉淀实验

表6 lncRNA KCNQ1OT1调控miR-486-5p表达

2.5 过表达miR-486-5p对舌鳞癌CAL-27细胞增殖和凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-486-5p组miR-486-5p表达水平升高，CAL-27细胞OD值降低，细胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表达水平降低，p21、Bax表达水平升高(P<0.05，见图4、5，表7、8)。

图4 过表达miR-486-5p对舌鳞癌CAL-27细胞凋亡的影响

图5 增殖和凋亡相关蛋白表达

2.6 下调miR-486-5p表达逆转了抑制lncRNA KCNQ1OT1表达对舌鳞癌CAL-27细胞增殖和凋亡的影响 与si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组比较，si-KCNQ1OT1+anti-miR-486-5p组miR-486-5p表达水平降低，CAL-27细胞OD值升高，细胞凋亡率降低，CyclinD1、Bcl-2表达水平升高，p21、Bax表达水平降低(P<0.05，见图6、7，表9、10)。

表7 过表达miR-486-5p对舌鳞癌CAL-27细胞增殖和凋亡的影响

表8 过表达miR-486-5p对舌鳞癌CAL-27细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

表9 下调miR-486-5p表达逆转了抑制lncRNA KCNQ1OT1表达对舌鳞癌CAL-27细胞增殖和凋亡的影响

表10 下调miR-486-5p表达逆转了抑制lncRNA KCNQ1OT1表达对舌鳞癌CAL-27细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的作用

图6 下调miR-486-5p表达逆转了抑制lncRNA KCNQ1OT1表达对舌鳞癌CAL-27细胞凋亡的影响

A:si-NC;B:si-KCNQ1OT1;C:si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC;D:si-KCNQ1OT1+anti-miR-486-5p。图7 增殖和凋亡相关蛋白表达

3 讨论

靶向治疗已成为癌症研究的前沿领域，开发生物标记物以增强舌鳞癌的早期检测和临床治疗具有重要意义[8]。研究发现 lncRNA可影响舌鳞癌细胞的恶性生物学过程[9]。已有研究表明KCNQ1OT1影响舌鳞癌细胞的增殖[3]。此外，KCNQ1OT1可通过充当miR-504的竞争性内源RNA来介导肝细胞癌的生长[10]。KCNQ1OT1通过调节miR-185-5p / Rab14轴促进口腔鳞状细胞癌细胞迁移并抑制细胞凋亡[11]。本实验结果显示，舌鳞癌组织中KCNQ1OT1表达水平升高；抑制KCNQ1OT1表达后，CAL-27细胞OD值降低，细胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表达水平降低，p21、Bax表达水平升高；表明抑制KCNQ1OT1表达可抑制舌鳞癌CAL-27细胞增殖，且促进细胞凋亡。

研究发现，miRNA可以作为可靠稳定的生物学指标，对肿瘤进行早期诊断和预后判断[12]。而lncRNA可与miRNA位点结合，从而影响和调节mRNA的表达[13]。本实验用生物学软件预测发现KCNQ1OT1靶向结合miR-486-5p。研究报道miR-486-5p可抑制白血病细胞的增殖并诱导凋亡[14]。本实验结果显示，舌鳞癌组织中miR-486-5p表达水平降低，过表达miR-486-5p后，CAL-27细胞OD值降低，细胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表达水平降低，p21、Bax表达水平升高；表明过表达miR-486-5p可抑制舌鳞癌CAL-27细胞增殖，促进细胞凋亡。研究报道LncRNA XIST通过靶向miR-486-5p和促进Neuropilin-2促进结直肠癌细胞的增殖和上皮间质转化[15]。本实验结果显示，KCNQ1OT1靶向调控miR-486-5p；下调miR-486-5p表达逆转了抑制KCNQ1OT1表达对舌鳞癌CAL-27细胞增殖和凋亡的影响。

综上所述，抑制KCNQ1OT1表达可通过靶向上调miR-486-5p抑制舌鳞癌CAL-27细胞的增殖，且促进细胞凋亡。