光、磁成像法探测脑胶质瘤微环境脑组织间隙结构及脑组织间液引流的变化*

王 彤 任蒙蒙 徐陆正 赵燕荣 邹 晶 韩鸿宾 袁 兰

(北京大学药学院化学生物学系 北京大学医药卫生分析中心，北京 100191)

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，复发率高，尤其是恶性胶质瘤[1]。经脑间质途径给药是避开血脑屏障的微创脑病治疗新技术，也是化学疗法治疗脑胶质瘤的新途径。Bobo等[2]提出的对流增强给药方法(convection enhancement delivery，CED)已于2009年获美国食品和药物管理局(FDA)批准用于脑胶质瘤的临床研究。组织间隙(extracellular space，ECS)是相邻脑细胞之间不规则、腔隙性结构，其内充满组织间液(interstitial fluid，ISF)和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)[3,4]。ISF是神经元细胞和胶质细胞的直接生存环境，负责物质交流、细胞间通讯，同时也是神经系统药物发挥作用的场所[5,6]。CED将药物分子在连续正压力下经导管注入脑实质内，认为药物借助压力可以在脑实质广泛分布[7]。然而，CED仍然存在局限性：①注入药物的浓度及分布很难监测和控制；②给药模式对脑组织具有一定的机械性损害；③注入的药物容易出现反流，从而降低疗效。针对CED存在的问题，本课题组提出经间质治疗的新方法——简单扩散给药方法(simple diffusion delivery，SDD)并将其成功应用于实验研究，证实经脑间质给予小分子神经保护药物的简单扩散给药方法可以有效预防大脑神经元的缺血性损伤[8]。但是，无论CED还是SDD，经脑间质途径给药始终缺少一种监测药物在脑内分布的有效手段。探讨脑胶质瘤内部药物清除、瘤内ECS结构特征及其变化规律，对于脑胶质瘤微创治疗方法的应用具有指导意义。

在本研究中，我们将基于示踪技术的MRI成像法与光学成像法结合起来，对药物在胶质瘤内的扩散过程进行实时可视化和定量评估。以Alexa Flour 594和钆喷酸葡铵(Gd-DTPA)分别作为光、磁示踪剂，比较药物在对照组大鼠的丘脑区及尾状核区ECS内以及在C6胶质瘤大鼠位于丘脑区及尾状核区的脑胶质瘤内随ISF的分布及扩散参数的改变，以期对胶质瘤区ECS的改变以及瘤内脑ISF引流情况进行更深的了解，从而为CED给药治疗脑胶质瘤方案的制定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

磁共振对比剂Gd-DTPA购自德国Bayer Schering Pharma AG；荧光探针Alexa Flour 594购自美国Life Technologies；戊巴比妥钠(25 g)购自美国Sigma-Aldrich；多聚甲醛(4%)购自北京索莱宝科技有限公司；转染试剂Lipofectamin 2000购自美国Invitrogen；二甲基亚砜、四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒购于美国Amersco。

激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP8 MP，Leica，德国)和流式细胞仪(FACS，BD FACSCalibur，美国)由北京大学医药卫生分析中心提供；3.0T磁共振成像仪(Magnetom Trio，西门子公司，德国)由北京大学第三医院提供；鼠脑立体定位仪和鼠脑模具购自深圳瑞沃德公司。

1.2 细胞系和实验动物[9]

C6胶质瘤细胞(ATCC No. CCL 107)，置于含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的改良Eagle培养基(DMEM)(高糖型)中，在37 ℃ 5% CO2条件下培养。

48只雄性SD大鼠购于北京大学医学部动物实验科学部[SYXK(京2008-0021)]，体重250～300 g。随机分为4组：丘脑对照组、丘脑肿瘤组，尾状核对照组、尾状核肿瘤组，每组12只。每组再随机分为光学示踪亚组及磁示踪亚组(n=6)。本实验严格遵守国家动物实验指南的要求，并获得北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会审查批准(批准文号：LA2018-306)。

1.3 C6胶质瘤细胞的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转染[10]

C6胶质瘤细胞接种在25 mm2培养瓶中至70%～80%融合，为获得稳定表达GFP的细胞，以Lipofectamine 2000为转染试剂，pEGFP-G为质粒载体。详细的实验步骤按照Lipofectamine 2000说明书操作。转染48 h后，以1∶10传代。用800 μg/ml G418分选GFP强阳性细胞，抗G418荧光阳性克隆出现在培养4周左右。流式分选法重复筛选荧光强度高的细胞。转染的细胞命名为GFP-C6细胞。

1.4 大鼠脑胶质瘤模型的制备[9]

丘脑肿瘤组和尾状核肿瘤组24只SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，固定在鼠脑立体定位仪上，分别按照丘脑(前囟：-3.5，+3.0，-6.0 mm)，尾状核(前囟：+1.0，+3.5，-6.0 mm)的立体坐标，在目标植入区上方颅骨上钻直径1 mm小孔。将GFP-C6细胞悬液10 μl(1×107细胞)以汉密尔顿微量注射器以1 μl/min的速度注入脑实质内，注射完毕后停针5 min，缓慢拔针。抗生素消毒伤口，牙科水泥封闭颅孔，以原条件饲养接种肿瘤的大鼠。

1.5 脑胶质瘤模型的检测及体积测定

胶质瘤种植第10天，用MRI对大鼠脑进行磁共振序列扫描(T1WI和T2WI)[9]。丘脑区、尾状核区胶质瘤种植区域出现T1WI低信号，T2WI高信号的团状异常信号表示胶质瘤建模成功。用MRI数据处理软件计算得到肿瘤体积。对光学示踪组的12只模型鼠脑切片同时进行共聚焦成像分析，观察是否得到有绿色荧光的肿瘤组织。

1.6 光学示踪法

以Alexa Flour 594(10 mmol/L)作为光学示踪法的示踪剂，对24只光学示踪组的SD大鼠(丘脑对照组、丘脑肿瘤组、尾状核对照组、尾状核肿瘤组各6只)进行示踪分析。腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，T1加权成像(3D T1WI MP-RAGE)序列进行MRI预扫描[9]。大鼠暴露颅骨后固定在鼠脑立体定位仪上，根据肿瘤种植部位确定打药位点：丘脑肿瘤组及尾状核肿瘤组进针处为MRI预扫描的肿瘤中心区域。对照组根据《大鼠脑立体定位图谱》确定打药位点。按照上述丘脑、尾状核的立体坐标，以微量注射器吸取Alexa Flour 594 2 μl以0.2 μl/min的速率注射，停针5 min后缓慢拔针。注射2 h后，大鼠心脏灌流取脑[11]，以4%多聚甲醛固定脑组织。固定12 h，鼠脑切片，在激光扫描共聚焦显微镜下观察ISF的扩散分布情况。

1.7 MRI示踪法

Gd-DTPA以0.9%NaCl溶液稀释至10 mmol/L作为磁示踪剂，对24只核磁示踪组的SD大鼠(丘脑对照组、丘脑肿瘤组、尾状核对照组、尾状核肿瘤组各6只)进行示踪分析。腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，T1加权成像(3D T1WI MP-RAGE)序列进行MRI预扫描[2]，记作T0，根据光学示踪法所述方法，按照上述丘脑、尾状核的立体坐标，以微量注射器吸取Gd-DTPA 2 μl以0.2 μl/min的速率注射。将大鼠置于MRI进行连续3D T1WI MP-RAGE序列扫描(注射后15、30、45、60、90、120、150、180、210和240 min)，扫描期间维持大鼠麻醉状态。

1.8 数据处理分析

2 结果

2.1 C6细胞GFP转染情况

C6细胞进行GFP转染后，使用激光共聚焦显微镜下观察GFP的表达。在488 nm激光激发下，GFP-C6细胞可以发出强烈的绿色荧光(图1A)。传代培养3个月后，C6胶质瘤细胞的荧光强度基本没有变化，冻存6个月以上的细胞，复苏后细胞存活良好，且荧光强度基本不变。

2.2 胶质瘤成像及MRI体积测定

GFP-C6细胞种于SD大鼠脑内10天，鼠脑切片的荧光图像显示胶质瘤区呈现绿色荧光，浸润性生长，破坏了原有区域的纤维组织(图1B)。从MRI的T2图像上可以观察到尾状核区、丘脑区胶质瘤的高信号(图1C)。通过MRI数据处理软件测得丘脑区肿瘤体积(128.61±2.04)mm3，尾状核区肿瘤体积(101.83±2.72)mm3。

2.3 丘脑肿瘤组脑ISF引流的变化

Gd-DTPA在丘脑对照组以及丘脑肿瘤组随时间扩散的MRI图像分别用矢状位、横轴位和冠状位表示(图2A)。比较Gd-DTPA在丘脑对照组和丘脑肿瘤组的扩散参数，相较于丘脑对照组，丘脑肿瘤组的清除速率(k’)、迂曲度(λ)显著增加，半衰期(t1/2)、有效扩散系数(DECS)显著减小(表1)。采用共聚焦显微镜采集丘脑对照组、丘脑肿瘤组的斜矢状位荧光图像(图2B)，结果显示，相较于丘脑对照组，丘脑肿瘤组的最大扩散面积显著增大。丘脑对照组及丘脑肿瘤组D-mapping图像更加直观地体现丘脑肿瘤组DECS减小(图2C)。

2.4 尾状核肿瘤组脑ISF引流的变化

Gd-DTPA在尾状核对照组以及尾状核肿瘤组随时间扩散的MRI图像分别用矢状位、横轴位和冠状位表示(图3A)。Gd-DTPA表现为高信号。比较Gd-DTPA在尾状核对照组和尾状核肿瘤组的扩散参数，相较于尾状核对照组，尾状核肿瘤组k’、λ显著增加，t1/2、DECS显著减小(表1)。采用共聚焦显微镜采集尾状核对照组、尾状核肿瘤组的斜矢状位荧光图像(图3B)，结果显示，相较于尾状核对照组，尾状核肿瘤组的最大扩散面积显著增大。尾状核对照组及尾状核肿瘤组D-mapping图像更加直观地体现尾状核肿瘤组DECS减小(图3C)。

图1 GFP-C6细胞的荧光图像及鼠脑胶质瘤检测：A. 488 nm激光下GFP-C6的荧光图像、光镜图像、荧光图像与光镜图像的叠加图；B.尾状核区、丘脑区胶质瘤的荧光图像,图中绿色部分代表胶质瘤，B1.尾状核胶质瘤，B2.丘脑区胶质瘤(标尺，2 mm)，B3.胶质瘤的高倍成像(标尺，100 μm)；C.胶质瘤的MRI T2WI序列成像，图中高信号区代表胶质瘤，C1.尾状核区胶质瘤，C2.丘脑区胶质瘤 图2 光、磁示踪剂在丘脑对照组和丘脑肿瘤组ECS中扩散分布图像及扩散参数：A. Gd-DTPA在丘脑对照组及丘脑肿瘤组中随时间扩散的MRI矢状位、冠状位、横轴位图像；B. Alexa Flour 594在丘脑对照组及丘脑肿瘤组中扩散2 h后的离体脑片图像，B1-1.丘脑对照组Alexa Flour 594扩散的荧光图像，B1-2.丘脑对照组脑切片的光镜图像，B1-3.丘脑对照组荧光图像与光镜的叠加图像，B2-1.丘脑肿瘤组Alexa Flour 594扩散的荧光图像，B2-2.丘脑肿瘤组脑切片的光镜图像，B2-3.丘脑肿瘤组荧光图像与光镜的叠加图像，B2-4.丘脑肿瘤组的肿瘤图像；C.丘脑对照组及丘脑肿瘤组的D-mapping图像，分别用二维、三维图像表示示踪剂在矢状位图像中的DECS值分布，红色代表DECS数值较大，蓝色代表DECS数值较小

表1 Gd-DTPA在肿瘤组与对照组中扩散参数的比较

DECS，有效扩散系数；k’，清除速率；λ，迂曲度；t1/2，半衰期；S，扩散面积

图3 光、磁示踪剂在尾状核对照组和尾状核肿瘤组ECS中扩散分布图像及扩散参数：A. Gd-DTPA在尾状核对照组及尾状核肿瘤组中随时间扩散的MRI矢状位、冠状位、横轴位图像；B. Alexa Flour 594在尾状核对照组及尾状核肿瘤组中扩散2 h后的离体脑片图像，B1-1.尾状核对照组Alexa Flour 594扩散的荧光图像，B1-2.尾状核对照组脑切片的光镜图像，B1-3.尾状核对照组荧光图像与光镜的叠加图像，B2-1.尾状核肿瘤组Alexa Flour 594扩散的荧光图像，B2-2.尾状核肿瘤组脑切片的光镜图像，B2-3.尾状核肿瘤组荧光图像与光镜的叠加图像，B2-4.尾状核肿瘤组的肿瘤图像；C.尾状核对照组及尾状核肿瘤组的D-mapping图像，分别用二维、三维图像表示示踪剂在矢状位图像中的DECS值分布，红色代表DECS数值较大，蓝色代表DECS数值较小

3 讨论

MRI和光学示踪法是国际上目前研究脑ECS常用的两种分析方法。MRI是临床常用的非侵入性活体成像方法，其具有较高的软组织分辨率，但其具有空间分辨率低的内在局限性，有时无法精确显示示踪剂分布的范围。荧光成像是一种灵敏度高的成像方法，然而其组织穿透力较弱。因此，将MRI与荧光成像技术联合既能提供高分辨率的组织学信息，又能实现高灵敏的功能学显像，在脑胶质瘤成像与诊断上具有广阔的应用前景[10]。本研究将这两种成像方法结合起来，共同评价其在丘脑、尾状核生长胶质瘤后脑ISF引流规律的变化。

本研究结果显示，丘脑肿瘤组及尾状核肿瘤组与其对照组相比，胶质瘤内部ISF的k’显著增加，t1/2显著缩短。这可能是由于胶质瘤区瘤内压力高于正常脑，小分子示踪剂注入瘤内后在压力驱使下快速清除[13]。丘脑区及尾状核区胶质瘤使ISF的DECS显著降低，同时丘脑及尾状核区胶质瘤的生长导致瘤内ECS的λ增加，这可能是由于肿瘤细胞生长迅速，细胞外基质成分增多，造成ECS结构和其内扩散的改变[9]。Aibo等[14]的研究显示，神经纤维束除具有电传导的功能外，还具有引导ISF引流的作用。因此，脑胶质瘤的生长所引起的脑ISF引流改变，可能与肿瘤生长导致肿瘤区邻近纤维束的破坏有关。

在我们的前期研究中[15]，利用MRI观察胶质瘤内部的药物扩散与分布，观察到药物只局限于胶质瘤内部，并不向胶质瘤外扩散。本研究将光学成像方法与MRI成像方法结合起来共同分析胶质瘤内药物的扩散过程，结果显示微量的药物可以从瘤内扩散至瘤周正常组织，这对于脑胶质瘤的药物治疗非常重要。

本研究阐明脑ISF在胶质瘤内药物扩散分布的规律，结合实验室前期对于药物在胶质瘤周的扩散分布的研究[9,15]，对于经ECS给药治疗胶质瘤具有重要的指导意义。