miR-130b通过调控p53抑制局灶性脑缺血大鼠神经细胞凋亡

邹瑜 钟纯正 郭春宣 王御林

(儋州市人民医院神经内科，海南 儋州 571700)

缺血性脑卒中发生率约占脑卒中发生率的80%，缺血性脑卒中的发生是由于各种原因引起的脑供血不足和氧气缺乏，导致脑组织坏死〔1～3〕。局灶性脑缺血后再灌注有时不仅能恢复正常脑功能，还会加重组织损伤和功能障碍，这称为脑缺血再灌注损伤。由于人体的补偿，再灌注引起的损伤只发生在一侧，即局灶性血液再灌注损伤〔4，5〕。凋亡与神经细胞死亡密切相关，并导致神经功能缺损。miRNAs是一类小的(19～24个核苷酸)非编码RNA，其通过介导翻译转录后抑制或促进RNA来靶向表达，它们在各种生物学和病理学过程，如细胞增殖、分化、凋亡和致癌作用中起重要调节作用〔6，7〕。至少20%～30%的人蛋白质编码基因的表达受miRNA的调节。在哺乳动物中枢神经系统(脑和脊髓)中发现了许多miRNA，它们在神经发育中起关键作用。 局灶性脑缺血改变miRNA表达参与许多继发性损伤反应，包括氧化应激，炎症和神经异常细胞凋亡。miR-130b通过抑制慢性坐骨神经压迫损伤(CCI)大鼠背根神经节(DRG)中Nav1.3抗体的表达抑制神经元细胞的凋亡〔8〕。此外，miR-130b通过调节抗凋亡基因Bcl-2的表达显示出神经保护作用。p53是常规的凋亡蛋白，可通过调控人内皮抑素基因(Cipt)表达而调控细胞生长，p53蛋白可刺激Cipt基因产生分子量为21 kD的蛋白，这种蛋白能够有效抑制某些促使细胞通过细胞周期进入有丝分裂的酶活性，从而促进细胞凋亡〔9，10〕。本研究拟探讨miR-130b、p53与局灶性脑缺血大鼠神经细胞凋亡的关系，为局灶性脑缺血的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1动物分组 SD大鼠60只，6～8周龄，体重250～300 g，山东大学医学院动物实验中心提供〔许可证号：SCXK(鲁) 20001003〕；本研究方案经本院动物研究委员会批准，符合美国国立卫生研究院动物使用和护理指南。动物随意获取食物和水，自动控制昼夜循环(12/12 h)，室温(22±1)℃，将大鼠饲养在12小时光-暗循环下，并允许在手术前后自由获取食物和水。大鼠根据体重随机分成3组：局灶性脑缺血组、miR-130b模拟物(mimics)组、miR-130b抑制剂组，每组20只，雌雄各半。

1.2立体定向转基因入脑 miR-130b抑制剂、miR-130b抑制剂质粒由上海生工科技有限公司合成，浓度分别为100 ng/μl、99 ng/μl，-20℃冰箱保存备用。将大鼠常规麻醉俯卧位固定于立体定向仪。头皮常毒、备皮，无菌操作，暴露颅骨表面、前囟、矢状缝，牙钻于距矢状缝右侧3.8 mm、前囟前1.7 mm处转孔，随后，微量加样器注入5 μl miR-130b mimics，注射结束5 min后撤出微量加样器，以骨蜡封闭颅骨孔道；相同方法于正中线右侧3.8 mm、前囟后3.3 mm、深2.3 mm处5 μl miR-130b mimics。局灶性脑缺血组、miR-130b抑制剂组分别用同样方法注入等量生理盐水或质粒miR-130b抑制剂，其他操作步骤同前。

1.3局灶性脑缺血大鼠模型的制备 通过大脑中动脉(MCA)的短暂闭塞诱导局灶性脑缺血。通过腹膜内注射30 mg/kg唑来样和10 mg/kg甲苯噻嗪的混合物诱导麻醉。将大鼠置于加热垫上的仰卧位置，根据直肠温度计将其体温保持在37℃±0.5℃。在手术显微镜下，通过中线切口暴露右侧颈总动脉，颈外动脉(EC)和颈内动脉(IC)。将EC结扎，凝固，并在舌和上颌动脉分支近端切断。 EC的所有其他分支被凝固并横切。然后将IC从迷走神经中分离以防止损伤。通过小切口将具有火焰圆头的4-0单丝尼龙缝合线插入IC、EC残端。从颈总动脉的分叉到缝合线尖端的距离大约为18.5 mm，这与大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的公开描述一致。通过使用激光多普勒血流计监测脑血流，其中柔性探针放置在由MCA提供的皮质区域中(后部2 mm和前囟侧部6 mm)。当通过线程封闭MCA时，未显示出至少70%的脑血流减少的大鼠被排除在实验之外。闭塞60 min后，取出缝合线缝合皮肤，让大鼠恢复。

1.4脑梗死灶内缘距上矢状线距离、脑梗死体积 试验结束后(24 h后)，颈椎脱臼处死大鼠，获取脑组织，立刻用游标卡尺测量上述两注射点中点三处冠状轴与脑梗死内缘的距离，并用显微图像分析系统分析脑梗死体积，随后将脑组织置于液氮中保存。

1.5大鼠局灶性脑缺血组织神经细胞凋亡检测 脑组织进行常规染色切片，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶) 介导的带荧光的三磷酸脱氧尿甘(dUTP)缺口末端标记法(TUNEL)检测大鼠神经细胞凋亡情况。

1.6各组大鼠局灶性脑缺血组织神经细胞凋亡率及G1期的测定 将脑组织制成神经单细胞悬液，流式细胞术膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)结合测定(R&D，Minneapolis，MN，USA，Cat No TA4638)用于测定各组神经细胞的细胞凋亡和细胞周期。 用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸分离细胞，并以1 000 r/min，离心5 min。 然后，洗涤细胞沉淀并重悬于微量离心管中的结合缓冲液中。 将5 μl FITC-缀合的AnnexinV和10 μl碘化丙啶(PI)加入管中，混合并在黑暗中温育10 min。 使用FACS Calibur系统测试标记的细胞，并测定凋亡百分比及细胞周期。

1.7各组大鼠局灶性脑缺血组织miR-130b、p53 mRNA表达水平的测定 使用mirVana RNA分离试剂盒(Ambion，CA)分离总RNA。 将微量脑组织在变性缓冲液中裂解，然后使用酸性酚：三氯甲烷提取RNA以除去大部分DNA。 进行定量实时PCR以量化各种处理期间特定总RNA的水平。 使用SYBR-green Rox mix在Master cycler梯度(Applied Biosystems 7500序列检测系统)中进行定量实时PCR。miR-130b引物序列为5′-TTTGCTTCAGGGTTTCA-TCC-3′(正向)和5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′(反向)；p53的引物序列为5′-CCCACTCACCGTACTAA-3′(正向)和5′-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT-3′(反向)；GAPDH(内标)是5′-CAGAACATCATCCCTGCCTCT-3′(正向)和5′-GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG-3′(反向)。

1.8各组大鼠局灶性脑缺血组织含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase6、caspase9蛋白表达水平的测定 按照无菌条件操作，称取0.1 g心肌组织，加入少量液氮，在研钵中迅速将脑碾碎至粉末状；将组织粉末转入2 ml EP管中，加入1.2 ml磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)，充分振荡混匀，5 000 r/min，4℃，离心20 min。仔细收集上清液。酶联免疫吸附试验(ELISA)用于测定组织液中caspase3、caspase6、caspase9的水平。

1.9统计学方法 采用SPSS23.0进行单因素方差分析、LSD-t检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1各组大鼠局灶性脑缺血组织脑梗死灶内缘距上矢状线距离比较 miR-130b mimics组脑梗死灶内缘距上矢状线距离显著高于局灶性脑缺血组〔(4.68±0.38)mm vs (2.59±0.32)mm;P<0.05〕，miR-130b抑制剂组〔(1.78±0.65)mm〕脑梗死灶内缘距上矢状线距离显著低于局灶性脑缺血组和miR-130b mimics组(P<0.05)。

2.2各组局灶性脑缺血组织脑梗死体积比较 miR-130b mimics组脑梗死体积显著低于局灶性脑缺血组〔(258±62)mm3vs (339±73)mm3;P<0.01〕，miR-130b抑制剂组〔(401±65)mm3〕脑梗死体积显著高于局灶性脑缺血组及miR-130b mimics组(P<0.05)。

2.3各组大鼠局灶性脑缺血组织TUNEL 阳性细胞数比较 miR-130b mimics组TUNEL 阳性细胞数显著低于局灶性脑缺血组〔(24.84±2.87)个 vs (39.70±2.54)个；P<0.05〕，miR-130b抑制剂组〔(47.94±2.12)个〕TUNEL 阳性细胞数显著高于局灶性脑缺血组及miR-130b mimics 组(P<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠局灶性脑缺血组织TUNEL 阳性细胞数比较(×200)

2.4各组局灶性脑缺血组织神经细胞凋亡率的比较 miR-130b mimics组神经细胞凋亡率显著低于局灶性脑缺血组(P<0.05)，miR-130b抑制剂组细胞凋亡率显著高于局灶性脑缺血组及miR-130bmimics组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.5各组局灶性脑缺血组织神经细胞凋G1期比较 miR-130b mimics组G1期显著高于局灶性脑缺血组(P<0.01)，miR-130b抑制剂组G1期显著低于局灶性脑缺血组及miR-130b mimics 组(P<0.05)。见表1。

2.6各组局灶性脑缺血组织miR-130b、p53 mRNA表达水平比较 miR-130b mimics组miR-130b mRNA表达水平显著高于局灶性脑缺血组(P<0.05)，p53 mRNA表达水平显著低于局灶性脑缺血组(P<0.05)；miR-130b抑制剂组miR-130b mRNA表达水平显著低于局灶性脑缺血组及miR-130b mimics组(P<0.05)，p53 mRNA表达水平显著高于局灶性脑缺血组及miR-130b mimics组(P<0.05)。见表1。

2.7各组局灶性脑缺血组织caspase3、caspase6、caspase9蛋白表达水平比较 miR-130b mimics组caspase3、caspase6、caspase9蛋白表达水平显著低于局灶性脑缺血组(P<0.05)，miR-130b抑制剂组caspase3、caspase6、caspase9蛋白表达水平显著高于局灶性脑缺血组及miR-130b mimics组(P<0.05)。见表1。

2.8各变量的相关性分析 miRNA-130b与p53、caspase3、caspase6、caspase9呈显著负相关(r=-0.569、-0.644、-0.543、-0.476，均P<0.001)。

表1 各组细胞凋亡率、G1期、miR-130b mRNA、p53 mRNA及caspase3、caspase6、caspase9蛋白表达水平比较

与局灶性脑缺血组相比:1)P<0.05；与miR-130b mimics组相比:2)P<0.05

3 讨 论

miR-130b在大脑的各个区域表达，尤其是在神经元及一些内分泌细胞类型和视网膜杆细胞中表达特别高，与线粒体功能密切相关。miR-130b在生理学上有非常重要的作用〔11〕。miR-130b可保护神经细胞免受脑卒中损伤，淀粉样蛋白毒性和缺氧损伤。遗传连锁分析发现脑神经元中miR-130b表达水平低，阿尔茨海默病风险增加。经历缺氧再灌注攻击的神经细胞的miR-130b能保护与维持线粒体功能、三磷酸腺苷(ATP)浓度及钙稳态。miR-130b实现这种神经保护活性的确切机制仍存在争议。研究表明，miR-130b可促进神经红蛋白的高水平表达，神经红蛋白可以提供储备氧储存，结合氧的神经红蛋白经历快速自动氧化并且对氧具有相对低的结合亲和力，因此，神经红蛋白似乎具有与氧气储存和运输分开的生理功能，神经红蛋白还能清除氧化应激产物一氧化氮〔12，13〕。研究表明〔14〕，miR-130b能抑制Rac1介导的肌动蛋白装配和膜微区的聚集，其参与死亡信号转导途径的调节。体外细胞试验〔15〕表明，miR-130b可截断线粒体凋亡途径源于观察到miR-130b迅速降低神经细胞色素水平。miR-130b对原代神经元及神经元细胞及受到低氧攻击的动物的保护作用与其抗线粒体凋亡途径密切相关〔16〕。

本研究结果说明miR-130b能明显降低大鼠局灶性脑缺血损伤程度，miR-130b能明显降低大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡程度。

细胞学试验表明，miR-130b抑制细胞凋亡与靶向p53的调控密切相关。肿瘤抑制因子p53起转录因子的作用，p53、p63、p73组成的细胞因子网络为发育过程与肿瘤发生之间紧密联系的证据〔17〕。p63可以响应应激信号诱导细胞生长停滞和凋亡，这两种功能特性与p53共有。据报道，肿瘤抑制因子p53、p63和p73作为miRNA加工组分的正调节剂和负调节剂起作用〔18〕。p53、p63和p73调节miRNA的加工，如let-7、miR-200c、miR-143、miR-107、miR-16、miR-145、miR-134、miR-449a、miR-503和miR-21。另一方面，p53受多种机制调节，包括转录mRNA及蛋白质稳定性。miR-130b miRNA参与p53调控〔17〕。此外miR-130b靶向调控p53抑制癌细胞的凋亡与G1-S相变的加速，p21Cip1和p27Kip1的下调及细胞周期蛋白D1的上调有关。p53的过表达是磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号转导及细胞周期进展至G1期的必要条件。此外，PI3K/AKT的激活增加p21Cip1和p27Kip1的细胞水平，并抑制细胞周期蛋白D1的表达，从而抑制细胞凋亡〔19〕。本研究结果说明miR-130b能抑制p53的表达进而抑制局灶性脑缺血大鼠神经细胞凋亡；同时也说明其抑制凋亡机制可能与抑制caspase3、caspase6、caspase9的表达有关。

综上所述，miR-130b能明显降低大鼠局灶性脑缺血损伤程度，降低神经细胞凋亡程度；其机制与miR-130b能抑制p53的表达进而抑制局灶性脑缺血大鼠神经细胞凋亡，抑制caspase3、caspase6、caspase9的表达有关。