胚胎嵌合的发生机制及结局

戴旭，贾苗苗，柏海燕

(西安医学院，西北妇女儿童医院，西安 710003)

在辅助生殖临床实践中，胚胎嵌合(mosaic embryos)是指植入前胚胎包含两种或两种以上染色体核型不同细胞系的现象。按照细胞类型嵌合体胚胎分为二倍体-非整倍体细胞系嵌合和非整倍体-非整倍体细胞系嵌合，在无整倍体胚胎可移植的情况下，我们仅考虑移植二倍体-非整倍体细胞系嵌合胚胎。国际胚胎植入前遗传学诊断协会(PGDIS)规定异常细胞占比20%～80%为嵌合体胚胎，>80%为非整倍体胚胎，<20%为整倍体胚胎[1]。

一、嵌合体胚胎的起源

嵌合体胚胎是胚胎有丝分裂过程中染色体异常分离所致[2]。卵母细胞异常、精子异常以及胚胎体外培养过程中的外源性干扰因素均可导致胚胎细胞染色体异常分离。精卵结合时卵母细胞提供早期胚胎发育所需的线粒体、mRNA以及适宜的细胞环境。精子仅头部进入卵母细胞，并以其中心体为中心形成精星体，介导雌雄原核融合以及第一次卵裂。与非整倍体的发生率主要受母方年龄影响不同[3]，嵌合体胚胎的发生率与父方因素更加相关。有研究显示不育男性的精星体通常会延迟形成，其介导的胚胎有丝分裂更易发生染色体异常分离[4]。Palmerola等[5]也证实，嵌合体胚胎的发生与精液参数相关，少弱精子症患者嵌合体胚胎的发生率较其他精子活力差的病人更高。在有关嵌合体的研究中，各个生殖中心报道的嵌合体胚胎发生率不同，提示体外受精(IVF)过程中各个技术环节，如促排方案、卵泡抽吸方式、培养室环境及培养液等均可能与嵌合体胚胎发生率相关[3]。

二、嵌合体胚胎的形成机制

染色体异常分离导致嵌合体胚胎形成的主要机制有：染色体不分离、分裂后期延迟、内复制。这几种机制本质都是细胞分裂过程中染色体异常分离的主要机制，并不是嵌合体胚胎形成所特有的机制。

1.染色体不分离(non-disjunction)：染色体不分离是指姐妹染色单体在有丝分裂中未分离，被纺锤丝牵引至同一子代细胞，在同一胚胎内形成三体-单体-二倍体三种细胞系嵌合。性染色体在胚胎发育的早期阶段最常发生不分离[6]，而常染色体发生不分离后丢失的单体细胞有致死性，在胚胎发育过程中会被选择性清除，最终会形成三体-二倍体细胞系嵌合胚胎。若不分离发生在胚胎细胞分化之前则会形成普遍性嵌合胚胎，其异常分离细胞分布于全身各个组织和器官，异常细胞占比在65%～70%之间[7]。若不分离发生在胚胎细胞分化之后特定的细胞谱系内则形成局限性嵌合。局限性嵌合的异常细胞仅分布于特定的某一个组织器官中，如限制性胎盘嵌合(confined placental mosaicism，CPM)，其异常细胞仅分布于胎盘组织，胎儿组织内无异常细胞。染色体不分离的分子机制还尚不清楚，有研究显示聚合蛋白对维持正常的有丝分裂有重要作用，它保证了姐妹染色单体之间的凝聚力。Singh等[8]研究发现，在小鼠模型中敲除聚合蛋白基因可以导致染色体错误分离概率升高，继而引起早期胚胎发育阻滞。

2.后期延迟(anaphase lagging)：后期延迟是指姐妹染色单体未能与纺锤体有效结合，或姐妹染色单体与纺锤体结合但没能正常进入子代细胞最终丢失，在同一胚胎内形成单体-二倍体细胞系嵌合[7]。后期延迟是嵌合体胚胎形成的主要机制，Ioannou等[9]通过对废弃的第5天胚胎研究发现，单体-二倍体细胞系嵌合的嵌合体胚胎发生率是三体-二倍体细胞系嵌合的7倍，这一结果也得到了Coonen等[10]和Capalbo等[11]人的证实。此外，后期延迟机制还是三体-二倍体细胞系嵌合胚胎自我修正的机制，三倍体细胞通过后期延迟机制清除多余的一条染色体恢复至正常二倍体细胞，称之为“三体营救”[11]。

3.内复制(endoreplication)：内复制是指细胞周期功能障碍，有丝分裂开始后迅速结束，染色体复制完成但胞质分裂未完成，或是一次有丝分裂刚刚结束，子代细胞的一条或多条染色体又再次复制但不分裂。内复制会导致多倍体-二倍体细胞系嵌合的胚胎出现，这类胚胎在通过“三体营救”机制自我纠正后还会出现染色体数目正常但表型异常的单亲二倍体(uniparental disomy，UPD)胚胎。UPD即同一胚胎内两条同源染色体均来自于同一亲本。UPD最常见于15、7、11和16号染色体[12]，人群发生率低，但会导致严重的发育迟缓和智力障碍，给家庭和社会带来沉重负担。

4.断裂-融合-桥循环(breakage-fusion-bridge)：这种异常分离会导致复杂的染色体重排而出现嵌合[13]，即染色体片段融合形成双着丝粒染色体。有丝分裂过程中每个着丝粒被拉向相反的纺锤体两极形成桥状物，然后染色体在新的位置断裂，断裂染色体片段复制后再融合开始新的循环[7]。

三、嵌合体胚胎的发生率

嵌合体胚胎的检出率依赖于不同的检测方法和检测平台，既往文献报道的嵌合体胚胎的检出率差异较大，从30%到90%不等[14]。欧洲人类生殖与胚胎学会指南(ESHRE)提到嵌合体胚胎的发生率为40%～60%[15]，这与各个中心早期使用荧光原位杂交技术(FISH)进行胚胎植入前遗传学检测(PGT)检测有关。FISH可以对单个细胞进行遗传学检测，是最早应用于PGT的检测方法，其依赖于特定的检测探针，无法对全部染色体进行筛查，且操作方法复杂、错误率高，不同生殖中心的实验室环境(温度、PH值、湿度等)也会影响其检测结果，现在除了满足平衡异位等特殊的检测需求，已经很少在PGT中使用。随着全染色体筛查(comprehensive chromosome screening，CCS)技术的发展，单核苷酸多态性分析微阵列(single nucleotide polymorphism array，SNP arrays)、微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization，aCGH)以及二代测序技术(next generation sequencing，NGS)等检测技术可以同时对24条染色体进行检测，其中NGS相较于其它检测方法具有高敏感度和准确性的优势[16]。其与aCGH检测技术相比较，aCGH将囊胚期活检的5～10个细胞作为一个整体分析，对整倍体细胞和非整倍体细胞混合检测；而NGS技术可对单个细胞的24条染色体进行逐一检测，更有利于嵌合体胚胎的检出。

有文献报道，嵌合体胚胎的发生率在卵裂期最高，为15%～75%[17]；囊胚期有所下降，在20%～33%之间[3]。由于囊胚期嵌合体发生率较低，且囊胚期活检对胚胎发育潜能的损伤较小，目前各生殖中心倾向于选择第5天或第6天的囊胚进行滋养外胚层活检。囊胚期活检相较于卵裂期活检的优势在于，囊胚期时对滋养外胚层细胞进行活检不损伤内细胞团，对胚胎的发育潜能损伤小，且大量的文献指出活检细胞控制在5～10个之间对胚胎的种植率几乎没有影响。囊胚期嵌合体检出率下降与胚胎的自我纠正有关，在胚胎组基因激活后非整倍体细胞占比越大的胚胎死亡越快，存活的嵌合体胚胎通过凋亡和丢失等方式清除异常细胞。对鼠胚的研究发现，在囊胚成熟的过程中，位于内细胞团的非整倍体细胞在发育过程中逐渐凋亡，而位于滋养层细胞的非整倍体细胞表现为生长发育受阻[18]。因此选择囊胚期活检不仅可以减少对胚胎的损伤还可以增加对胚胎的利用率。

不同染色体异常在嵌合体胚胎中的发生率不同，21和22号染色体最短且是端着丝粒染色体最易发生染色体异常分离，嵌合体胚胎的检出率分别是4.01%和3.81%。1、2和6号染色体较减数分裂在有丝分裂过程中更易发生错误，嵌合体胚胎的发生率(分别为3.23%、3.62%和3.04%)高于非整倍率发生率(分别为1.29%、1.55%和1.62%)。1、2、5、9号和X等染色体的着丝粒在有丝分裂过程中不稳定，易出现结构畸变，产生部分非整倍体-二倍体细胞系嵌合胚胎[16]，特殊的部分非整倍体嵌合胚胎在卵裂期的发生率为24.3%，囊胚期略低为15.6%[19]。

四、嵌合体胚胎研究中的难点

嵌合体胚胎研究中面临的最大难点是PGT对嵌合体胚胎诊断的准确性。PGT检测准确性的影响因素包括活检细胞的代表性和遗传检测技术的灵敏度和可靠性。滋养外胚层细胞活检的准确性受诸多因素影响，如染色体嵌合的类型、异常细胞的占比、活检过程的操作方式、活检细胞数量及活检部位等。目前的研究证实嵌合体胚胎中的异常细胞是随机均匀分布于滋养外胚层和内细胞团内的，Chuang等[20]发现无论是活检靠近还是远离内细胞团的滋养外胚层细胞，其嵌合体的检出率与内细胞团本身基本一致。为了不损伤胚胎的植入潜能，滋养外胚层的活检细胞数局限在5～10个之间，但Gleicher等[21]通过数学模型计算，提出假设嵌合细胞在滋养外胚层中分布均匀，至少需要活检27个滋养外胚层细胞才能代表整个囊胚染色体核型。Maxwell等[22]取不同部位的滋养外胚层细胞进行多次的重复检测，发现两次结果的一致率为48.3%。但也有学者证实同时利用FISH和aCGH技术对内细胞团和3个不同位置的滋养外胚层细胞进行活检，其一致率可达到97%[23]。而且我们通过滋养层细胞的活检结果，来选择整倍体胚胎进行植入，有效地提高了妊娠率，降低了流产率。囊胚期滋养外胚层细胞活检基本可以代表内细胞团的遗传学状态，但这一结论还需要更大数据量的临床对照实验来证实。

此外，NGS技术对嵌合体胚胎虽具有较高的灵敏度和检出率，但因NGS读取数据的长度短于传统的测序技术，而且在序列拼接过程中错误率为0.1%～15%，对于大量数据的分析也面临着严重的挑战[24]。

五、嵌合体胚胎的临床结局

嵌合体胚胎是介于整倍体和非整倍体之间的第三种胚胎类型，在无整倍体胚胎可以移植的情况下，可以考虑移植嵌合体胚胎。且随着PGT检测技术的发展，囊胚期嵌合体胚胎的检出率和检出类型都显著增加。NGS-PGT的嵌合体检出率可达到30%[25]。在PGT周期中，优先为患者移植整倍体胚胎，但检测结果只有嵌合体胚胎时，是否可以移植仍不明确，有的中心通过设置临界点来规定胚胎是否可以移植，一般认为异常细胞比例<40%的胚胎可以移植[26]，异常细胞>50%的嵌合体胚胎临床妊娠率、植入率和活产率均显著低于整倍体囊胚(分别为15.2% vs. 46.4%，24.4% vs. 54.6%和15.2% vs. 46.6%)[27]，不建议移植。嵌合体胚胎的发育潜能同时还受嵌合类型影响，例如：两条以及两条以上染色体嵌合的复杂嵌合体胚胎只有10%的植入率[26]，而染色体部分非整倍体嵌合的胚胎其发育潜能几乎不受影响。Fragouli等[28]报道，经NGS诊断为嵌合体的44枚胚胎中，染色体部分非整倍体嵌合占比为32%，它的妊娠结果与整倍体胚胎相似，活产率为57.1%，自然流产率无明显差异。

与非整倍体胚胎不同，嵌合体胚胎也可以成功种植并获得正常活产。可能机制有：(1)从嵌合体胚胎中分离活检细胞时存在取样误差，滋养层细胞活检结果并不完全代表内细胞团中的遗传状态，PGT出现了假阳性结果。(2)胚胎发育过程中可能存在自我纠正机制，包括：优势细胞选择性分布、整倍体细胞代偿以及异常细胞凋亡和丢失等。截止2018年全球有近100例嵌合体胚胎成功种植[29]，Fragouli等[28]移植44个嵌合体胚胎后有12个最终正常活产。但与滋养外胚层细胞活检正常的囊胚种植率(55.8%)相比，嵌合体胚胎的种植率(30.1%)显著降低。Besser等[30]发现，移植嵌合体胚胎和选择废弃嵌合体胚胎重新移植整倍体胚胎的两组患者间的持续妊娠率也有显著差异(27.6% vs. 51.2%)。

目前还未有移植嵌合体胚胎后出生的儿童长期大量的随访结果。但有研究发现，除了17号染色体外，几乎所有出现嵌合的染色体都有成功妊娠的报道[26]。新生儿的临床表现以及严重程度与其染色体类型、异常细胞比例以及分布相关。严重的新生儿嵌合可导致先天畸形、自闭症和精神发育迟缓等。例如Turner综合征中嵌合体占比37.8%，嵌合型为45，X/46，XX的患者易发生甲状腺功能不全，少部分嵌合型为45，X/47，XXX的Turner综合患者还表现为精神异常[31]。

六、嵌合体胚胎的遗传咨询

移植嵌合体胚胎虽然存在种植率低、流产率高且有出生缺陷胎儿的风险，但经过遗传咨询后并非所有患者都会选择丢弃嵌合体胚胎。Besser等[30]对98名只有嵌合体胚胎的患者进行遗传咨询后，仍有32.7%的患者选择移植嵌合体胚胎。因单倍体胚胎不能存活(除45，X外)，而某些三倍体胚胎可导致胎儿身体或认知障碍，所以对于最终选择移植嵌合体胚胎的患者，PGDIS在关于嵌合体胚胎遗传咨询指南中建议：(1)相较于二倍体-三倍体细胞系嵌合，优先移植二倍体-单倍体细胞系嵌合。(2)当选择移植二倍体-三倍体细胞系嵌合胚胎时，应根据嵌合的程度以及受累染色体选择最优胚胎，优先考虑转移包括：1，3，4，5，6，8，9，10，11，12，17，19，20，22，X和Y染色体的三体嵌合；与单亲二倍体(14，15)相关嵌合三体胚胎的优先级较低；与宫内生长迟缓(2，7，16号染色体)相关嵌合三体胚胎的优先级较低；能够存活(13，18，21号染色体)的嵌合三体胚胎优先级最低[32]。同时充分告知患者嵌合体胚胎结局的不确定性和流产、胎儿异常、必要时终止妊娠等各种可能的风险，并需在妊娠14周时进行产前诊断通过羊膜腔穿刺术(amniocentesis)确诊胎儿染色体核型。

七、结语

胚胎嵌合是在胚胎发育过程中染色体异常分离所导致的特殊现象，有关其形成机制以及不同的胚胎嵌合类型对胚胎发育的具体影响尚不清楚，随着PGT技术的发展，NGS对于嵌合体的诊断更加灵敏，检出率更高。嵌合体胚胎具有一定的生存潜能，但其种植率、妊娠率均低于整倍体胚胎。对患者进行PGT遗传咨询后，少数患者在无整倍体胚胎情况下，最终选择移植嵌合体胚胎，成功妊娠后需接受羊水穿刺检查，并对出生婴儿需进行长期随访，以积累更多的嵌合体胚胎数据。