细胞因子和缺氧诱导因子及微RNA对类风湿关节炎滑膜细胞的作用

徐凯捷，欧阳桂林

(1.上海中医药大学，上海 201203； 2.上海市光华中西医结合医院关节外科，上海 200052)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以侵袭性关节炎为主要表现的自身免疫性疾病，其特征为滑膜炎症[1]。该病好发于手、腕、足等小关节，呈对称分布，随着疾病的进展，可逐渐扩散到腕踝、膝髋等关节，RA若不及时有效地进行治疗，则可能损害关节、甚至导致残疾。人体关节腔内关节囊覆盖关节软骨面，而关节囊可分为内层和外层，外层纤维层坚韧且厚、由致密结缔组织组成，内层滑膜层薄而柔软、由疏松结缔组织组成，滑膜层可分泌滑膜液起润滑营养、减少关节软骨摩擦等作用。滑膜可分为滑膜衬里层和滑膜衬里下层，其中滑膜衬里层是RA中炎症的主要部位[2]，常驻细胞为成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)和巨噬细胞样滑膜细胞(macrophage-like synoviocytes，MLS)，而FLS为中心细胞，其通过促进滑膜炎、血管翳生长参与 RA的许多病理过程，最终导致软骨和骨破坏。在类风湿炎症中，FLS分泌各种促炎细胞因子，而细胞因子分泌可影响其他免疫细胞，特别是MLS与滑膜的相互作用，MLS可通过分泌活性氧类、一氧化氮中间体、基质降解酶等促进RA进展；此外，MLS在RA滑膜中产生不同种类的细胞因子，可通过募集其他免疫细胞并激活FLS来加速炎症反应[3]。因此，FLS和MLS作为RA的关键影响因素，被越来越多的学者作为研究RA的主要靶向细胞，且以FLS为主。现就细胞因子、缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)和微RNA(microRNA，miRNA)对RA滑膜细胞的作用予以综述。

1 细胞因子与滑膜细胞

在RA、系统性红斑狼疮、脊柱关节炎等风湿免疫疾病中，细胞因子是重要的信号分子，其通过特定受体介导细胞之间的通讯来协调免疫反应。细胞因子是一类具有广泛生物活性的小分子蛋白，其由免疫细胞或其他细胞经刺激而合成及分泌，RA滑膜细胞和滑膜组织中分泌多种细胞因子，这些细胞因子对免疫的调节不平衡，包括抗炎细胞因子产生的不足和促炎细胞因子产生的增加、两者作用导致慢性炎性病症[4]。其中，常见的细胞因子有肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-17等。

1.1TNF-α TNF-α是TNF家族的成员，在介导炎症反应及细胞死亡中起重要作用，被证明是RA炎症的主要介质[5-6]。TNF-α主要由巨噬细胞、单核细胞等产生，最初作为跨膜蛋白合成，通过与以两种不同形式存在的受体(TNF受体1和TNF受体2)结合而发挥作用[7]。研究表明，TNF-α刺激滑膜不仅能导致促炎细胞因子的表达和产生[8]，也可以刺激滑膜细胞及软骨细胞合成前列腺素E2与胶原酶[9]。Zhang等[10]试验发现，TNF-α可促进RA-FLS的增殖，并抑制程序性细胞死亡因子5的信使RNA转录和蛋白表达。吕邵娃等[11]经酶联免疫吸附剂测定发现，与非TNF-α组相比，TNF-α组诱导FLS的炎症因子IL-6和抗凋亡因子B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)水平显著升高。Shibasaki等[12]采用蛋白质组学分析技术发现，TNF-α可诱导FLS内信号转导及大量纤溶酶原激活物抑制剂2，而相关纤溶酶原激活物抑制剂主要分布在增生和浸润性滑膜组织的滑膜衬里区域。可见，TNF-α对于滑膜细胞具有增殖和促炎作用，而阻断TNF-α能够改善滑膜炎症，延缓关节的破坏，因此在临床上使用TNF-α抑制剂具有较好疗效[13]。

1.2IL-1 IL-1家族包含11个成员，其存在IL-1α、IL-1β两种形式，IL-1可调节固有免疫和适应性免疫应答、涉及效应细胞的募集和活化，参与炎性肠病、RA等疾病[14-15]。同时由于IL-1在炎症小体激活的下游起关键作用，故被认为是许多自发性疾病的致病性细胞因子[16-17]。研究发现，炎症相关因子IL-1β和TNF-α可促进FLS增殖并产生IL-1α、IL-1β等，从而进一步加重滑膜炎症反应[18]。Chen等[19]在实验中使用IL-1β诱导炎症，结果观察到IL-1β刺激显著增加RA-FLS的细胞活力，表明IL-1β能诱导FLS增殖。Tsai等[20]证实，与未刺激组相比，IL-1β刺激组诱导增加了滑膜细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)1及促炎细胞因子(TNF-α和IL-6)的表达。可见，IL-1β在滑膜细胞的增殖、炎症促进方面具有重要的调节作用。

1.3IL-6 IL-6是具有广泛作用的炎症细胞因子，RA-FLS可以自发分泌多种促炎细胞因子，如IL-6、IL-8以及MMP(MMP-1和MMP-3)，它们在关节的逐渐破坏中起重要作用[21]。另外，FLS受到IL-1和TNF-α等炎症细胞因子的刺激会分泌IL-6[22]。同时，IL-6刺激对FLS也会产生重要影响，Narazaki等[23]认为IL-6在FLS或其他细胞中诱导血管内皮生长因子，且IL-6刺激FLS和成骨细胞产生核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)，RANKL激活破骨细胞，导致骨质疏松和关节破坏。Kaneshiro等[24]通过检测细胞周期调节子p16INK4a、p21Cip1、p27Kip1及细胞周期蛋白依赖性激酶4、细胞周期蛋白依赖性激酶6的表达，证实IL-6和TNF-α协同调节细胞周期并促进RA-FLS增殖。因此，IL-6与滑膜细胞的增殖和炎症反应密切相关[25]。

1.4IL-17 IL-17包括从IL-17A到IL-17F的6个家族成员，其中IL-17A和IL-17F是主要的成员，两者均通过与IL-17受体A和IL-17受体C结合起作用[26]。IL-17是对先天性和获得性免疫应答至关重要的促炎细胞因子之一，主要由辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)17分泌，也可由中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞等细胞诱导产生[27]。研究显示，IL-17能抑制滑膜细胞的凋亡[28]、促进滑膜细胞的增殖和介导炎症的产生[29]。Lee等[30]研究发现，与骨关节炎患者相比，RA患者FLS中抗凋亡基因Bcl-2表达水平较高，而IL-17进一步上调了RA-FLS中Bcl-2的表达，同时CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测显示IL-17促进FLS的增殖。另有学者从细胞凋亡调控基因-程序性细胞死亡因子5方面进行研究发现，RA患者滑液中的程序性细胞死亡因子5水平和IL-17水平呈负相关，表明IL-17与滑膜细胞增殖有关[31]。在介导炎症方面，Hirota等[32]证实粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)是自身免疫性关节炎的关键炎症介质，Th17细胞通过IL-17刺激FLS分泌GM-CSF，导致RA炎症的发展。同时，有研究证实IL-17在促进FLS中IL-6、IL-8和粒细胞集落刺激因子以及MMP的产生中具有增强和协同效应，且特异性抗IL-17抗体在体外阻断细胞因子和趋化因子反应方面表现出良好的效果[33]。Shui等[34]研究发现，IL-17A通过诱导FLS中MMP-13的表达来抑制共培养系统中软骨细胞Ⅱ型胶原纤维α1基因信使RNA和蛋白的表达，从而增加胶原蛋白的降解并在RA相关的软骨损伤中发挥作用。van Nieuwenhuijze等[35]在小鼠关节内联合注射GM-CSF腺病毒表达载体和IL-17腺病毒表达载体揭示了滑膜中MMP、NF-κB配体的受体激活剂RANKL和IL-23产生的累加和协同作用，导致关节破坏，而联合注射IL-17和GM-CSF的抗体治疗显著降低关节破坏程度。可见，IL-17能促进FLS的增殖、诱导炎症细胞因子、与其他细胞因子产生协同作用及增强MMP的表达，对滑膜炎症、关节破坏有重要影响。因此，IL-17可以作为治疗RA的重要靶点。

2 HIF与滑膜细胞

HIF是由一个α亚基和一个β亚基组成的异二聚体分子，被认为是调节细胞氧平衡反应基因表达的核转录因子，HIF-α分为HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α三个α亚基，HIF能调节低氧环境的适应性反应，而缺氧是RA的重要微环境特征。研究证明，缺氧和HIF调节RA的许多重要病理生理特征，包括滑膜炎症和软骨破坏等[36]。HIF-1α在多种类型细胞中普遍表达，其对滑膜细胞增殖、炎症等有影响。

HIF-1α在RA滑膜组织中高表达，能促进滑膜细胞的增殖[37]。Li等[38]研究表明，HIF-1α可上调CXC趋化因子受体4，而CXC趋化因子受体4与基质细胞衍生因子-1结合促进RA-FLS活化、迁移和增殖。对于HIF-1α信号的抑制则减弱了RA患者滑膜中激活的FLS的侵袭性[39]。在RA滑膜细胞中，HIF-1α能影响FLS与T细胞和B细胞之间的关系，能诱导炎症细胞因子、细胞间接触介质、趋化因子、血管细胞黏附分子的产生[40]。Lee等[41]发现，RA-FLS的存活可以通过B细胞活化因子表达控制、受HIF-1α与B细胞活化因子启动子结合的调节。另有文献报道，HIF-1α的过表达可增强RA-FLS介导的炎症性Th1和Th17细胞的扩增，并增强Toll样受体配体刺激的RA-FLS中炎症细胞因子的表达，从而引起RA向炎症性状态的转变；在RA微环境条件下，低氧和HIF-1α可能与Toll样受体刺激的先天性免疫反应共同发挥作用，以驱动RA炎症[42]。同时，HIF-1α又受细胞因子、相关刺激蛋白等调控而影响滑膜细胞。Hu等[43]研究表明，IL-33可以在RA-FLS中诱导更多的HIF-1α表达，从而形成HIF-1α/IL-33调节回路，进一步增加HIF-1α的表达。Park等[44]发现，高迁移率族蛋白B1通过Toll样受体4/NF-κB信号通路诱导HIF-1α表达及其活性的增加，从而诱导血管生成。Li等[45]在研究民族药刺老苞提取物对FLS的细胞凋亡作用时，发现该提取物降低了抗细胞凋亡因子Bcl-2、HIF-1α和磷酸化蛋白激酶B的蛋白水平，表明FLS的细胞凋亡诱导作用与细胞凋亡相关蛋白的表达调节和对蛋白激酶B/HIF-1α信号通路的抑制有关。另外，在低氧条件下IL-17A诱导MMP-2和MMP-9的表达时可发现，NF-κB/HIF-1α的激活增加，表明IL-17A还可通过激活NF-κB/HIF-1α途径上调MMP-2和MMP-9的表达促进RA-FLS的迁移和侵袭[46]。

已有研究证明，缺氧条件下的RA-FLS经历上皮-间充质转化，细胞迁移和侵袭增加，而缺氧诱导的上皮-间充质转化伴随HIF-1α表达的增加和蛋白激酶B的激活，进一步影响FLS的迁移和侵袭[47]。在研究IL-17与缺氧在FLS中的作用时，Samarpita等[48]认为IL-17和缺氧协同增强滑膜巨噬细胞中HIF-1α、MMP-9的表达，而HIF抑制剂可消除IL-17和缺氧介导的HIF-1α和MMP-9表达。另有实验证明，关节缺氧可能会不同程度地影响RA-FLS中IL-1β 刺激的MMP-1和MMP-13表达，而HIF-1α基因敲除可明显缓解缺氧对MMP-1和MMP-13表达的影响，表明由低氧介导的IL-1β刺激的RA-FLS中MMP-1和MMP-13表达的差异取决于HIF-1α的表达[49]。因此，测试针对靶向HIF-1α的疗效时，应考虑这种低氧介导的差异作用。

3 miRNA与滑膜细胞

miRNA是一类内源性非编码小RNA，其具有组织或发育阶段特异性的表达模，通过结合靶信使RNA 3′非翻译区中的互补区来调节转录后水平的基因表达[50]。研究发现，miRNA不仅在调节免疫功能中具有重要作用，还可通过调控细胞信号中某些信号分子(细胞因子、转录因子、生长因子等)的表达来调节细胞代谢和发育、促进细胞增殖与分化、调控细胞凋亡[51-52]，在RA中起重要作用。其中，常见与滑膜细胞有关的miRNA包括miR-124、miR-155、miR-142等。

3.1miR-124 miR-124具有重要的细胞抑制作用，以往其在肿瘤抑制方面有大量研究，近年来研究将其作为自身免疫性疾病的新型诊断指标[53]。研究发现，miR-124a在RA-FLS中的表达水平明显降低，占骨性关节炎成纤维细胞表达水平的1/6[54]，将miR-124a的前体转染至RA-FLS后可抑制其细胞增殖、使细胞周期阻滞在G1期。有学者分析了RA和骨性关节炎患者滑膜组织中miR-124a基因的甲基化状态，证明该基因启动子仅在RA中被甲基化，可能与miR-124a下调有关[55]。鉴于RA-FLS中miR-124的低表达情况，学者对miR-124的调控进行了研究，发现其能抑制大鼠佐剂诱导的关节炎，表现为滑膜细胞增殖减少，白细胞浸润和软骨或骨破坏减少[56]。Yang等[57]研究也表明，miR-124a不仅能抑制RA-FLS的活性和增殖，增加G1期细胞的百分比，还能抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达。因此，miR-124在FLS的炎症和增殖抑制方面起重要作用，其将成为RA治疗的重要靶点，如以负载miR-124的方式用于RA治疗[58]。

3.2miR-155 miR-155是一种多功能miRNA，对于免疫应答必不可少，其能调节树突状细胞的成熟，控制B细胞增殖，是T细胞分化的调节剂，也是RA免疫慢性激活的关键介质[59]。研究发现，与骨性关节炎成纤维滑膜细胞相比，RA-FLS中miR-155表达上调，miR-155的过表达在体外也能抑制RA-FLS的侵袭，且用miR-155模拟物转染的RA-FLS能降低MMP-3水平，但沉默miR-155能明显升高MMP-3水平[60]。Li等[61]研究表明，miR-155通过调节Wnt信号通路抑制RA-FLS的活力并诱导细胞凋亡。同时有研究认为，miR-155在促炎激活中起关键作用，其能减少细胞因子信号转导抑制蛋白1的表达，可能有助于RA患者的TNF-α和IL-1β产生增加[62]。Liu等[63]研究发现，TNF-α能诱导FLS增殖，而miR-155抑制剂可减少TNF-α诱导的FLS增殖及IL-6和IL-1β产生。因此，miR-155不仅能降低MMP-3水平，还能增加促炎症细胞因子的产生，但miR-155的多功能性是否参与了不同的调节机制需进一步探讨。

3.3miR-142 miR-142编码两种成熟的miRNA：miR-142-5p和miR-142-3p[64]，其是器官形成、体内稳态的多方面调节剂，在疾病中也起重要作用，如在癌症、病毒感染、炎症和免疫耐受中发挥功能性作用[65]。与骨性关节炎滑膜成纤维细胞相比，miR-142-3p、miR-142-5p在RA-FLS中的表达水平明显上调[66]。Meng等[67]研究发现，脂多糖刺激RA-FLS下调了miR-142-3p，而丹酚酸B通过上调miR-142-3p、调节NF-κB和c-Jun氨基端激酶途径预防和逆转细胞损伤，具有抗凋亡和抗炎作用。同时，有学者发现下调miR-142-3p能抑制TNF-α诱导的RA-FLS增殖、侵袭和炎症；且miR-142-3p下调通过靶向IL-1受体相关激酶抑制NF-κB信号转导[68]。可见，miR-142-3p在肿瘤研究中具有双重作用，其可能在RA滑膜细胞中发挥不同的调控作用，今后需进一步探索。

4 小 结

RA是一种慢性炎症性免疫疾病，随着研究的深入发现，RA的特征为发炎的滑膜中滑膜细胞的增殖，以及炎症因子的滑膜细胞表达，因此其治疗策略通常集中于控制这些细胞的增殖和炎症介质[69]。目前，RA的病因病机尚未明确，其进展也被认为是多因素综合作用的结果，因此在研究影响滑膜细胞的因素中，需进一步探索细胞因子之间的等级关系、HIF及miRNA的调节体系。同时，也有学者研究了HIF、miRNA、细胞因子三者在软骨细胞中的表达[70]。今后在研究RA滑膜细胞时应多考虑三者之间的关系，以寻找更好的RA治疗手段。