细胞铁死亡发生机制的研究进展

梅胜兰，夏中元，孟庆涛，周金剑

(武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060)

铁死亡是Dolma等[1]用小分子化合物Erastin诱导Ras癌基因突变的人包皮成纤维细胞死亡时发现的一种程序性细胞死亡方式，使用凋亡、坏死、自噬、焦亡等抑制剂均不能逆转Erastin和谷胱甘肽过氧化物酶抑制剂RSL3导致的细胞死亡，而抗氧化剂(维生素E)和铁螯合剂(去铁胺)却能逆转。2012年，Dixon等[2]将Erastin诱导的具有自己独特形态学、基因学、生物化学特征的细胞死亡方式正式命名为铁死亡。在形态学方面，铁死亡主要表现为线粒体膜固缩，膜密度增加，线粒体嵴模糊不清、减少或消失，细胞核膜完整[3]；在生化方面，表现为铁离子水平升高，产生大量活性氧类(reactive oxygen species，ROS)，谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)活性下降，脂质代谢产物堆积；在分子机制上，有研究发现，核转录因子红系2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)在叶酸诱导的急性肾损伤小鼠中通过抑制铁死亡发挥肾脏保护作用，这可能是Nrf2除抗氧化应激、抗炎等保护作用外的另一个崭新机制[4]，而GPx4是Nrf2转录途径介导的唯一基因，是有效修复氧化损伤的硒蛋白，因此Nrf2/GPx4是调控细胞铁死亡的关键信号通路。

细胞铁死亡存在于多种疾病的病理生理过程中，研究发现在肿瘤疾病中，其可通过诱导细胞铁死亡杀灭肿瘤细胞；在神经退行性疾病中，可通过抑制细胞铁死亡延缓疾病的进展[5]。然而，铁死亡的研究仍处于早期阶段，还有很多问题尚待解决。现就细胞铁死亡的发生机制予以综述，以为铁死亡的深入研究及临床疾病的防治提供新靶点与理论基础。

1 铁死亡发生的相关机制

1.1铁离子调控

1.1.1铁代谢 铁是机体不可缺少且含量最丰富的微量元素，其参与体内多种重要的生理生化功能。铁是血红蛋白和肌红蛋白合成主要原料，其不仅参与了DNA、ATP的生物合成，也是线粒体中重要的电子传递链和金属蛋白酶的辅助因子，如铁硫蛋白不仅是线粒体电子传递链中氧化还原酶类的重要辅助因子，还是氧化还原反应过程中许多重要酶的辅助因子[6]，包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、泛醌等。因此，机体健康的维持，铁至关重要。正常条件下，机体通过食物来源的铁和“铁循环”(衰老的红细胞在血红素加氧酶作用下释放铁离子，巨噬细胞再次吞噬回收利用铁的过程)保持铁的动态平衡。由肝脏合成分泌的铁调素直接调控血清铁的水平，而机体细胞内铁稳态的调节，则主要通过铁调控蛋白系统——铁反应元件发挥作用。外周循环中的三价铁离子(Fe3+)与转铁蛋白结合形成复合物后与细胞膜上的转铁蛋白受体结合，进入细胞内的内涵体，此时的Fe3+通过铁氧还原酶Steap3(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate)还原为二价铁离子(Fe2+)，随后在二价金属离子转运蛋白1的介导下，Fe2+从内涵体解体释放到细胞质，一部分储存于不稳定的铁池，过多的铁则存储在铁蛋白轻链多肽和铁蛋白重链多肽1组成的铁储存蛋白复合物中，剩余部分Fe2+将被氧化成Fe3+转出细胞，参与体内铁再循环。

1.1.2铁离子与脂质过氧化 当体内铁的分布、含量异常时，就会发生各种损伤与疾病。有研究将Fe2+加入脊髓神经元的培养液中，发现铁离子的水平与脂质自由基、丙二醛等过氧化产物的产生量呈正相关，而神经元的活性与脂质过氧化产物产生量呈负相关，说明铁与ROS是铁死亡的启动子与介质[7]。研究表明，含有多不饱和脂肪酸的细胞膜、质膜等特别容易与脂质自由基发生过氧化反应，而在Fe2+的存在下，这种反应速度极大提高[8]。另有研究发现，抗氧化剂(α维生素E和β胡萝卜素等)和铁螯合剂(去铁胺)能够显著抑制Erastin诱导的细胞铁死亡，说明铁稳态和脂质过氧化是细胞铁死亡发生的关键环节[2]。铁也是铁死亡的必要条件，补充铁离子可以加速Erastin 诱导的细胞铁死亡，而其他二价金属离子却没有此作用。

上述结果揭示一种现象：铁离子水平越高，脂质过氧化反应越强烈，细胞损伤即铁死亡越严重。铁离子启动脂质过氧化的反应为：当组织损伤或缺血缺氧时，细胞代谢发生障碍，pH下降致细胞内Fe3+还原成Fe2+，Fe2+通过与过氧化氢发生Fenton反应促进了氧自由基的产生，其中羟自由基最具有破坏性，其不仅能够在体内与其邻近的分子发生急速反应，同时还能够促进与细胞的脂质成分发生过氧化生成大量脂质自由基，由于细胞膜、质膜含有丰富的多不饱和脂肪酸，脂质自由基如同级联反应，进一步导致细胞膜、质膜变薄失去屏障作用，细胞内ROS随即加剧破坏胞膜、质膜，并在细胞膜上形成蛋白质孔，导致细胞内稳态紊乱[9]，激活更严重的生化反应；另一方面，脂质自由基损伤细胞的脂质结构，产生的脂质过氧化产物(4-羟基壬烯醛、丙二醛等)并没有静止，而是继续反应，不断破坏细胞，最终导致细胞膜、质膜的结构和功能不可逆的破坏，这就是铁依赖性的脂质过氧化死亡即铁死亡。见公式(1)、(2)[10]。

Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH

(1)

(2)

铁螯合剂能够直接作用于含铁离子的酶，其中以脂氧合酶的可能性最大，因为它能催化多不饱和脂肪酸氧化，并能直接被亲脂性铁螯合剂失活。而Dixon和Stockwell[11]认为，铁具有在有氧条件下极易与其他物质交换电子的特性，铁螯合剂之所以抑制细胞铁死亡，其原因可能为：铁是很多重要金属酶的辅酶，其阻止了铁向氧化物传递电子，从而抑制氧自由基的产生，即抑制了细胞脂质过氧化，进而抑制了铁死亡的发生。

1.2Nrf2/GPx4途径 Nrf2基因位于人染色体 2q31.2，其编码的蛋白是一种具有亮氨酸拉链结构、含有605个氨基酸的转录因子，不仅能够调控细胞内稳态的平衡，还能对抗机体外源性和内源性氧化损伤，调节人类抗氧化蛋白的表达，是氧化还原的关键基因。Nrf2对细胞内的Fe2+具有调控作用，正常条件下Nrf2保持无活性状态，当受到ROS刺激或亲电子物质等诱导时就发生分子构象改变，激活下游的抗氧化酶发挥抗氧化、抑制细胞铁死亡的作用[12]；另有研究发现，铁死亡的相关基因包括Nrf2，上调Nrf2，其下游的抗氧化蛋白基因(如GPx4和血红素加氧酶1)表现为促进编码转录；而敲除Nrf2基因或Nrf2靶基因的肝细胞肝癌细胞可增强铁死亡诱导剂Erastin或索拉菲尼诱导的铁死亡[13]。Nrf2抑制剂(如全反式视黄酸、葫芦巴碱、鸦胆子苦醇)通过抑制金属硫蛋白1G(一种富含半胱氨酸残基的蛋白质)的表达，增加了谷胱甘肽的消耗、脂质过氧化，促进索拉非尼诱导的铁死亡[14]，进一步证实 Nrf2 具有抑制铁死亡的作用。而GPx4是Nrf2转录介导的基因，是能够特异地将高毒性的脂质过氧化氢转化成无毒的脂醇，将过氧化氢分解成水，是一种对哺乳动物中不饱和脂肪酸的氧化损伤能够有效修复的硒蛋白[15]。有文献报道，敲除小鼠GPx4基因或使用GPx4抑制剂RSL3能导致细胞内超氧阴离子和羟自由基明显增加以及脂质过氧化，最后诱导细胞铁死亡的发生[16]；而GPx4基因全身敲除，则小鼠胚胎在7.5 d死亡[17]。因此，抗氧化酶GPx4是铁死亡发生的至关重要的调控蛋白，而Nrf2/GPx4是调控细胞铁死亡的关键信号通路。

1.3胱氨酸/谷氨酸反向转运体(cystine/glutamate antiporter，System XC-) System XC-是一个膜Na+依赖的氨基酸反向转运体，广泛分布于生物细胞的磷脂双分子层，是由轻链溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)和重链溶质载体家族3成员2组成的异二聚体，当摄取一分子胱氨酸的同时外排一分子谷氨酸[18]。在细胞内，胱氨酸首先被还原为半胱氨酸，然后在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶的作用下合成谷胱甘肽，谷胱甘肽在抗氧化应激、减轻脂质过氧化反应、保护组织细胞等方面发挥至关重要的作用。当System XC-被阻断时，谷氨酸与胱氨酸不能互换，导致细胞内谷氨酸堆积，谷胱甘肽合成减少，GPX4活性降低，从而使细胞发生铁死亡[19]；研究报道，基因沉默SLC7A11表达会使HT-1080细胞对铁死亡诱导剂Erastin诱导的铁死亡更加敏感，而将HT-1080细胞过表达SLC7A11后，细胞对铁死亡的耐受明显增强[20]。可见，System XC-对细胞铁死亡有重要作用。

1.4电压依赖性阴离子通道 (voltage-dependent anion channel，VDAC) VDAC位于线粒体外膜，具有调节线粒体的代谢和产能功能，并参与细胞生存和死亡信号的调节，是转运离子和代谢产物的跨膜通道，包括VDAC1、VDAC2和VDAC3等多种亚型。VDAC开放时允许呼吸底物、ADP、磷酸进入线粒体，在关闭状态下则封闭线粒体的转运功能[21]。动态“开放-封闭”将对线粒体代谢和细胞生物能量产生重大影响。微管蛋白是VDAC上的一种球形蛋白，它可以通过阻塞VDAC来动态调节线粒体代谢及离子的转运[22]。VDAC被微管蛋白阻塞而关闭后，限制代谢物流入线粒体和ATP产生，随后线粒体代谢被抑制并维持较低ATP/ADP比值，从而减少氧化应激。Erastin可抑制 VDAC上的微管蛋白功能，阻止细胞质游离微管蛋白对VDAC的阻塞，使VDAC开放。VDAC开放会引起线粒体代谢增加，糖酵解减少，ROS生成增加。研究发现，铁死亡诱导剂Erastin作用于VDAC后，线粒体外膜的通透性增加，膜离子通道开放，细胞内稳态失衡，导致线粒体代谢及氧化功能紊乱，ROS生成增加，脂质过氧化增强，进而引起细胞铁坏死的发生[23]。另有研究表明，抑制VDAC2或VDAC3表达后，细胞对Erastin诱导的铁死亡不敏感，但上调VDAC2或VDAC3，Erastin诱导铁死亡的敏感性并没有明显提高，提示VDAC2或VDAC3并非铁死亡的必需条件[24]，而只是参与了铁死亡调节的过程。有文献报道，VDAC1蛋白主要维持线粒体中钙离子平衡和ROS水平，因此也与铁死亡发生密切相关[25]。

1.5p53 p53是抑癌基因，其对调控细胞的生长周期、影响肿瘤细胞代谢、诱导细胞凋亡、促进DNA损伤等有重要影响。研究发现，p53除了抑制肿瘤外，对机体的衰老、帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病发挥限制作用[26]。Jiang等[27]研究发现，p53通过乙酰化致突变后，能够抑制System XC-活性，下调SLC7A11的表达，抑制胱氨酸进入细胞，减少谷胱甘肽合成，降低GPx4活性，从而促进脂质过氧化，诱导细胞铁死亡的发生；同时，他们还发现激活p53基因后，存在于线粒体外膜的SLC7A11基因信使RNA在肿瘤细胞中呈高表达，可抑制p53基因的负调控，从而证实SLC7A11为p53基因的新靶点。近年研究发现，p53能通过增强谷氨酰胺酶2的活性，催化谷氨酸大量产生，因胱氨酸与谷氨酸以1∶1转运，故细胞内高浓度谷氨酸必然减少胱氨酸进入细胞，从而减少谷胱甘肽合成，诱发细胞铁死亡的发生[28]。此外，有研究报道亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1高表达可增强脂肪氧合酶活性，而p53通过增强此酶的活化功能，促进细胞不饱和脂肪酸氧化，导致细胞铁死亡[29]。p53与铁死亡的激活关系密切，在骨肉瘤、肺癌中表现更明显，其机制与p53直接抑制System XC-有关，且在肿瘤的抑制与调节铁死亡作用中，p53的乙酰化至关重要[30]。

2 铁死亡与相关疾病

2.1铁死亡与肿瘤 目前发现，多种肿瘤细胞对药物诱导的铁死亡十分敏感。如胰腺癌细胞对凋亡产生耐受，但对细胞铁死亡敏感，Eling等[31]发现青蒿脂可诱导胰腺癌细胞铁死亡，从而抑制肿瘤的生长；Lin等[32]发现，双氢青蒿素可诱导头颈部鳞状细胞癌细胞发生铁死亡；西拉美新和拉帕替尼则可以诱导乳腺癌细胞发生铁死亡[33]。因此，诱导肿瘤细胞发生铁死亡从而抑制肿瘤的增殖与转移，可能成为未来肿瘤治疗的新靶点。

2.2铁死亡与神经退行性疾病 阿尔茨海默病和帕金森病是临床常见的神经退行性疾病，其发病率逐年增加，不仅严重影响患者的生活质量，也给家庭、社会造成沉重负担，但其发病机制尚不明确。Ayton等[34]发现，在阿尔茨海默病患者大脑中铁蛋白增多与阿尔茨海默病风险基因载脂蛋白E-ε4表达水平升高一致，表明大脑中铁含量的增加影响阿尔茨海默病进程。在成年小鼠GPx4缺失模型中发现海马神经元与星形胶质细胞减少，这与阿尔茨海默病患者的病理改变一致[35]；Pichler等[36]发现，帕金森病患者黑质致密部铁含量增加，多巴胺能神经元氧化损伤明显加重，谷胱甘肽耗竭，羟自由基水平升高，表明在帕金森病中，铁死亡参与了多巴胺能神经元的变性死亡；Do等[37]发现，铁死亡抑制剂ferrostatin-1能抑制1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶对多巴胺能神经元的毒性作用，以上进一步表明铁死亡参与了神经退行性疾病的病理过程。

2.3铁死亡与脏器缺血再灌注损伤 在脏器缺血再灌注损伤中，存在细胞坏死、凋亡、自噬等。近来研究发现，在小鼠模型中，通过抑制细胞铁死亡，可显著减轻心脏、肝、肾、脑等的缺血再灌注损伤[38-39]；Tang等[40]发现，大鼠心肌缺血再灌注损伤后，铁稳态调节通路被激活，铁离子堆积，ROS生成增加，最终导致铁离子依赖的氧化损伤即铁死亡，表明铁死亡参与了心肌的缺血再灌注损伤。因此，抑制细胞铁死亡可能成为临床防治脏器缺血再灌注损伤的新方法。

3 小 结

细胞死亡是机体正常新陈代谢的需要，是所有细胞的最终命运，在整个机体的正常运转以及病理生理过程中具有不可替代的作用。线粒体基质和线粒体嵴是真核生物氧化代谢的场所，线粒体含有丰富的脂质，也是对缺血缺氧及各种损伤最为敏感的细胞器之一。而铁死亡是铁依赖的脂质过氧化物超量蓄积和ROS引起的细胞程序性死亡方式，线粒体嵴减少或消失，线粒体膜固缩是否可以作为铁死亡早期的和特征性的形态学改变，有待进一步探讨；另外，参与细胞铁死亡的信号通路与其他调节性细胞死亡方式之间是否存在潜在的相关性也有待深入研究。相信随着基础与临床研究的不断进步，铁死亡一定会更好地应用到临床疾病特别是肿瘤的防治中。