骨骼发育中骨骼干细胞的鉴定

石玉

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医学院 成都 610041

骨是骨骼系统的核心组成部分，因结构高度矿化而具有坚固而稳定的特性。骨骼的功能除保护重要器官以及帮助人体自由运动外，骨髓腔内存在大量的生命活动所必需的造血细胞；同时，骨骼可分泌调节碳水化合物和矿物质离子代谢的激素，提供大量的钙和磷酸盐储备，可用于调节全身性矿物质离子稳态。因此，骨骼结构内多种不同类型细胞相互作用，使骨骼具有众多重要功能。骨骼细胞处于一个高度复杂、密闭的硬组织包围的环境中，导致在技术和概念上严重制约了对其中各类细胞的研究。

骨骼干细胞是处于骨骼细胞分化链条上游的重要细胞群，其研究成为硬组织领域的重点和难点之一。目前，对骨骼干细胞尚无明确且统一的鉴定标准；骨骼细胞谱系的复杂性以及缺乏对骨骼干细胞特异性标志物的掌握，也阻碍了对这些重要细胞群的理解。不过可以确定的是，以往认为一种或几种类型的全能干细胞就可以协调骨骼发育和再生的想法并不准确，当前的观点更支持多种不同类型的骨骼干细胞相互协作并共同分化形成骨组织。

1 骨骼发育

在骨骼系统中，最为主要的细胞类型是前成骨细胞（pre-osteoblast）、成骨细胞（osteoblast）、骨衬细胞（bone lining cell）以及骨细胞（osteocyte），这些细胞都是由骨骼干细胞（skeletal stem cell）分化形成的不同阶段的骨骼谱系细胞（osteoblast lineage cell）[1]。目前公认的观点是，骨骼干细胞位于骨骼谱系细胞的上游，通过复杂且精细的调控，形成这些前期或者终末分化状态的细胞。目前所知的干细胞的特征是具有两种重要功能：1）自我更新，即在保持其特性的同时进行自我复制的能力；2）多向分化潜能，即向多种类型细胞分化的能力。骨骼在其整个生命周期中经历了许多生物学上重要的步骤，例如形态发生和发育、激增性增长和功能成熟、稳态维持以及组织结构的再生与修复。在每个步骤中，骨骼干细胞都会提供新鲜的具有生物活性的骨细胞，保持骨骼的强度和功能。

在不同的胚胎期骨形成生理解剖位置，研究者发现颅颌面骨处的骨骼干细胞来源于神经嵴细胞（neural crest cell）；躯干骨处的骨骼干细胞来源于近轴中胚层（paraxial mesoderm）；四肢骨处的骨骼干细胞来源于侧板中胚层（lateral plate mesoderm）。根据骨骼发育方式，骨形成可分为膜内成骨（intramembranous ossification）和软骨内骨化（endochondral ossification）[2]。在传统意义上，膜内成骨是指骨骼干细胞聚集并直接形成骨细胞的过程，主要是颅颌面骨以及锁骨的形成方式；软骨内骨化是指骨骼干细胞聚集形成软骨组织和包围在其外的软骨膜细胞，软骨细胞增殖进而肥大，激活重要的分化信号通路[例如Indian Hedgehog（IHH）等]，随后促进软骨膜细胞逐渐形成骨细胞，主要发生在四肢骨以及躯干骨部位[2]。在骨发育过程中，众多转录因子发挥关键作用，比如软骨形成过程中的Sox9基因，骨细胞早期的关键分子Osx、ATF4以及Runx2等。干细胞成骨分化过程又受到局部信号分子Wnt、Notch、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）以及Hedgehog通路调节；同时全身系统性的调控（如PTH、Fgf23等）也可以促进骨-牙等硬组织形成[1]。

2 骨骼干细胞的传统鉴定方式

基于恢复人体骨组织功能的再生医学及组织工程学的发展大大地推动了对于骨骼干细胞的研究。近年来，对于骨骼干细胞的认识来源于人类和啮齿类动物骨髓细胞的实验。“细胞的体外培养鉴定”以及“细胞异体移植至裸鼠体内进行检测”已经作为鉴定骨髓来源干细胞的金标准。体外鉴定主要指研究细胞是否具有多向分化潜能以及克隆形成能力；异体移植检测主要观察细胞移植至裸鼠体内后可否形成骨组织[3]。

发现骨髓中存在具成骨能力干细胞的实验要追溯到20世纪60年代。这项实验中，Friedenstein等[4]发现将人类骨髓细胞皮下移植到免疫缺陷小鼠体内时，这些细胞最终形成了包含微血管的小骨组织。随后发现一种具有单克隆形成能力的成纤维样细胞，命名为克隆形成单位-成纤维细胞（colony-forming unit fibroblast，CFU-F），其具有成骨向分化能力，也是异体移植后形成小骨组织的细胞来源[5]。与此类似，来自啮齿动物的骨髓细胞同样具有相似的特性。当时，学者们认为存在于人和啮齿动物骨髓中的CFU-F是骨骼干细胞。尽管CFU-F在体外培养条件下普遍具有相似的克隆形成能力，但在基因表达和功能上具有高度异质性。实际上，只有一部分CFU-F具有自我更新和多向分化能力，可以在体外多向分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，或形成异体移植后的小骨组织[6]。根据目前的定义，骨骼干细胞其实仅仅是CFU-F的一个子集[7]。更为重要的是，单一克隆的CFU-F在移植到裸鼠体内后，小骨形成的效率大大降低[6]，这表明不同的CFU-F之间可以相互依存，功能上可以相互补充，更有利于体内重建造血微环境和骨组织，这是单一CFU-F无法实现的。

在供体体内，无法直接区分CFU-F与骨骼干细胞，只能利用体外培养再通过异体移植实验进行清楚的鉴别，因此干细胞表面分子标志物的引入为骨骼干细胞的鉴定提供了重要的研究手段。

3 骨骼干细胞表面分子标志物

长期以来，单克隆抗体和流式细胞分选技术一直用于鉴定非培养状态下的间充质干细胞。在人类细胞中，细胞表面分子CD271被证明可以标记所有3个胚层的细胞，包括非神经细胞类型[8]。随后，研究者[9]发现，CD271甚至在造血活动出现之前就标记了成人和胎儿骨髓中的基质细胞。在人类骨髓细胞中，CD271可以单独或与其他细胞表面标志物一起富集CFU-F[10-12]。

STRO-1抗体被发现可以鉴定和富集人源骨髓间充质细胞[13]。

在Bianco团队[6]的一项重要研究中，细胞表面分子CD146被证明可以标记处于骨髓中窦状血管外膜上的网状细胞（reticular cell），这些CD146阳性细胞中富含CFU-F，并能够在移植到裸鼠体内后形成有血管存在的异位骨。更为重要的是，将这个异位骨组织进行酶解、消化后，收集到的细胞可在体外培养并形成单克隆集落，从而证明了CD146阳性细胞在体内的自我更新能力[6]。进一步的研究[14]表明，CD51、血小板衍生生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα）双阳性细胞只是CD146阳性细胞中的一小部分，其具有更强的克隆形成能力。PDGFRα、干细胞抗原-1（stem cell antigen-1，Sca-1）双阳性非造血细胞（PαS细胞）在体内位于血管周围空间，同时在体外可以形成单克隆[15]。如果将这些细胞在非培养状态下与造血干细胞共移植到受辐射照射的受体小鼠体内，可以分化为成骨细胞、基质细胞、脂肪细胞；更重要的是这群细胞同样高表达PDGFRα与Sca-1。这些结果表明PαS细胞在体内具有自我更新的能力，是一群骨骼干细胞。

随后的研究[16]表明，在人类骨髓中，CD271高表达的具有克隆形成能力的细胞在体外展现出多向分化潜能，并且在体内可以分化为骨小梁区域的骨细胞。CD271、CD146双阳性细胞群体具有异体移植后成骨的特征。

其他实验[17]表明，CD271、Thy1（CD90）和VCAM-1（CD106）组合可富集CFU-F。此外，将未培养的CD271、Thy1双阳性细胞移植到裸鼠体内后，可以在其骨髓中检测到这群细胞的存在，说明了这群细胞属于骨骼干细胞。

此外，将骨小梁周围结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）阳性间充质干细胞分化形成的间充质细胞移植到体内，同样具备干细胞特性[18]。最新的研究成果[19]显示，在小鼠腿骨中，应用CD51（αV integrin）、CD90（Thy）、CD105（endoglin）以及CD200（OX2）可以分离骨骼干细胞。在人体骨骼中发现的PDPN（Podoplanin）阳性、CD146阴性、CD73阳性、CD146阳性的细胞为人源骨骼干细胞[20]。类似的，许多其他标志物可以作为骨骼干细胞的细胞表面标志分子，例如Sca-1以及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。因此，将干细胞表面标志物、细胞体外鉴定以及细胞异体移植实验相结合的研究手段对骨骼干细胞的鉴定提供了更为全面的信息。

4 利用转基因小鼠鉴定骨骼干细胞

研究者也应用遗传学手段将特定的标记分子（例如可表达特异颜色荧光蛋白的基因或编码β-半乳糖苷酶的lacZ等）克隆到特异基因位点的3"端，并构成新型转基因小鼠。在这种转基因小鼠体内，当某种细胞表达特异基因时，该基因所连结的标记分子也随之表达，因而达到标记这群细胞的目的。

使用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的Nestin-GFP转基因小鼠是首先被用于研究骨髓多能间充质干细胞的小鼠模型。在该模型内，GFP的表达受到Nestin基因表达的调控[21]。Nestin是一种中间丝蛋白，是神经干细胞的标志物。Nestin-GFP在围绕骨髓小动脉的细胞中高表达，而骨髓中的Nestin-GFP阳性细胞具有克隆形成能力，可形成具有自我复制能力的“间充质球”，并具有多次异体移植能力[22]。Nestin-GFP阳性细胞中的CD51、PDGFRα双阳性亚群具有更强的克隆形成能力[23]。随后，在Nestin-GFP标记的细胞群体内发现2个不同的亚群，Nestin-GFP高表达的细胞亚群比较罕见，仅位于小动脉周围，具有更强的克隆形成能力且常常处于静止状态；Nestin-GFP低表达的细胞亚群数量较多，呈网状，主要分布在动脉窦小血管附近，表达高丰度的瘦素受体（leptin receptor，LepR）[14]。

趋化因子（CXC基序）配体[chemokine （CX-C motif ）ligand，CXCL]12是趋化因子（CXC基序）受体[chemokine（C-X-C motif）receptor，CXCR]4的配体，在造血阶段的初期和中期发挥重要作用[24-26]。在CXCL12-GFP转基因小鼠体内发现，骨小梁上网状细胞高表达GFP（代表高表达CXCL12），因此将该细胞群命名为CXCL12丰富网状（CXCL12 abundant reticular，CAR）细胞；而在内皮细胞和成骨细胞中，GFP表达水平很低甚至检测不到（代表CXCL12低表达）[25]。对CAR细胞的深层次研究[27]表明，该细胞群除表达常规骨骼干细胞的细胞表面分子（例如VCAM1、CD44、CD51、PDGFRα和PDGFRβ）外，还是干细胞因子（stem cell factor，SCF）的主要分泌来源。基因表达分析表明，该群细胞在体外和体内均表现出成骨向和成脂肪分化的能力。

图1中,设定输入光场为Ein,输出光场为Eout,谐振腔内耦合区域前后的光场分别为E1和E2,耦合区域的耦合系数和透射系数分别为k和t。k与t满足k2+t2=1。输出端的光功率为Iout=|Eout|2,输出端的光功率为Iin=|Ein|2。φ代表谐振器的往返相位,L是谐振器周长,β是传播常数,φ=βL。那么反射式光波导谐振腔的传递函数表示为

5 利用体内谱系追踪方式鉴定骨骼干细胞

目前，研究特定细胞在体内生理情况下的分化及维持的金标准是使用转基因小鼠的谱系追踪（lineage tracing）实验。使用该方法在体内研究细胞谱系时，对机体不会产生任何损伤，因此非常适合研究发育过程。

通常，谱系追踪实验通过Cre-LoxP技术用生物系统永久性标记感兴趣的细胞。 Cre重组酶在第一个转基因中以启动子/增强子特异性方式表达，并在第二个转基因中作用于处于Rosa26基因座的报告基因位点。在该基因座中，包含polyA序列在内的多个序列以及翻译终止密码子（“STOP”序列），阻止了报告基因的继续转录和翻译。这些“STOP”序列的两侧是loxP位点，当Cre重组酶作用于Rosa26基因座并除去“STOP”序列时，报告基因在特异性启动子的指导下表达，因此可以将表达特异性启动子/增强子的细胞进行标记。

改良的谱系追踪版本利用遗传学手段将报告基因与Cre-ERT转基因放在同一个实验小鼠体内，这样既可以保证报告基因在特定细胞内表达（何处表达），又可以通过外源药物控制基因在特定时间表达（何时表达）。Cre-ERT小鼠是一类可表达雌激素受体的配体结合区突变体（ERT）与Cre重组酶的融合蛋白的小鼠。在未受他莫昔芬（tamoxifen）诱导的情况下，Cre-ERT在细胞质内处于无活性状态；当转基因小鼠受他莫昔芬诱导后，他莫昔芬的代谢产物4-羟基他莫昔芬（雌激素类似物）与ERT结合，可使Cre-ERT进入细胞核，发挥Cre重组酶活性。在体内，他莫昔芬的有效时间有限，一般在24～48 h内可以暂时激活CreloxP重组系统，然后逐渐被细胞清除。因为在报告基因位点发生的重组是不可逆的，即使驱动Cre重组酶表达的启动子不再具有活性，只要表达Cre的细胞存活下来，报告基因就会在靶细胞及其后代中持续表达。这就是小鼠体内谱系追踪的简要工作原理。

目前，对于标记分子已开发出了几种版本、经修饰的Rosa26报告基因等位基因，包括R26R-lacZ（编码β-半乳糖苷酶）、R26R-YFP[编码黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）]、R26R-tdTomato（编码红色荧光蛋白的串联二聚体，DsRed）和R26R-Confetti。最后一个等位基因编码4种不同的荧光蛋白，即核GFP、YFP、tdTomato和蓝绿色荧光蛋白（blue-green fluorescent protein，CFP）。 应该注意的是，每个版本都有其自身的优点和缺点。例如，尽管R26R-Confetti等位基因提供了4种可能对体内克隆分析有用的颜色，但是转基因设计的复杂性要求loxP切除和倒置，该等位基因对Cre-loxP重组相对不敏感。

虽然利用体内谱系追踪技术研究干细胞还处在初期阶段，但是越来越明显的是，骨髓并不是骨骼干细胞所处的唯一环境，胚胎期也不是干细胞存在的唯一时期。在骨骼中的其他重要位置（例如骨膜和生长板），在发育的不同时间段甚至是成体中，也存在着具有不同功能的骨骼干细胞亚群。

5.1 机体发育早期阶段的骨骼干细胞鉴定

在发育的早期阶段，局部的干细胞出现并分化成间充质干细胞，随后发生聚集和进一步分化。在四肢发育过程中，骨骼细胞来源于侧板中胚层。因为转录因子Prrx1在这些中胚层细胞中表达，对这一时期的研究多应用Prrx1-Cre转基因小鼠。其中Cre重组酶在2.4 kb的Prrx1启动子调控下表达，基本上标记了后期所有肢体间充质细胞（包括软骨细胞、软骨膜细胞、成骨细胞和基质细胞），但不标记肌肉细胞[28]。Sox9基因在间充质细胞聚集期表达，并刺激Ⅱ型胶原（collagen 2，Col2）的产生。Sox9-Cre和Col2-Cre都以与Prrx1-Cre类似的方式标记几乎所有的软骨细胞、软骨膜细胞和成骨细胞[29]。

Osx（Sp7）是骨骼形成的重要调控因子，用成骨特异的Cre敲除Osx基因，会导致骨骼形成缺陷。在胚胎期标记Osx阳性细胞，其子代细胞可以在新生期阶段分化为骨细胞以及间充质细胞，但随着机体的成长，这群细胞最终消失，不能继续形成骨骼系统[32]。

5.2 新生儿阶段的骨骼干细胞鉴定

与胚胎期时标记的Osx阳性细胞不同，在小鼠出生后第5 d标记的Osx阳性细胞可以在小鼠一生中持续分化为骨细胞、间充质细胞以及骨髓脂肪细胞。这说明，在机体内Osx基因呈现多次高表达，而每次表达标记的细胞种类并不相同。

Gremlin 1（Grem1）是一种BMP拮抗剂，在血管周围的骨髓基质细胞中表达[33]。使用Grem1-CreERt进行的谱系追踪实验表明，这些细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞和网状基质细胞，但不能分化为骨髓脂肪细胞，因此被命名为“骨-软骨-网状细胞共同的干细胞（osteo-chondro-reticular，OCR）”[34]。Sox9-CreERt2、Col2-Cre-ERt2以及Aggrecan-CreERt2阳性细胞在新生儿期被标记后，与Osx阳性细胞具有相似的分化能力[35]。但值得注意的是，传统意义上软骨细胞的特异标志基因Sox9、Col2以及Aggrecan所标记的干细胞具有成骨向分化能力，在一定程度上揭示了干细胞的来源不仅仅局限在骨髓腔内。

5.3 机体成年阶段的骨骼干细胞鉴定

在成年期Nestin-CreERt2转基因小鼠，可以标记到一类随后可分化为骨细胞、脂肪细胞以及骨髓基质细胞的骨骼干细胞；此外，还可以标记内皮细胞，这一特性不利于后期实验中对于特定表型的分析与解释。

LepR由动脉窦血管和小动脉周围的骨髓基质细胞表达。使用LepR-Cre转基因小鼠进行基因体内追踪实验，结果表明这些LepR阳性细胞可以分化为成年小鼠（尤其是年龄大于2个月的成年小鼠）骨骼中的大部分具有克隆形成能力的细胞，其中包括成骨细胞和骨髓脂肪细胞等[36]。与胚胎期相似，成年小鼠中的Gli1-CreERt2阳性细胞可以分化为成骨细胞、脂肪细胞以及LepR阳性的间充质细胞[30]。但是，成年期Osx阳性细胞的成骨向分化能力有限[32]。

小鼠骨髓Mx-1阳性细胞具有体外多向分化能力，但是在体内的分化潜力有限，仅标记了不到5%的骨髓脂肪细胞。同样的，在骨折损伤修复过程中，新形成的软骨组织中并未检测到Mx-1阳性细胞。这些结果证明，Mx-1阳性细胞是具有有限分化能力的前体细胞，能够在体外持续分化为成骨细胞，但无法满足骨骼干细胞的全部特性[37]。

5.4 其他部位骨骼干细胞鉴定

除骨髓腔之外，外骨膜、软骨膜以及生长板处也存在骨骼干细胞。软骨膜处骨骼干细胞同样具备CFU-F特性，有克隆形成能力，同时具有高度的再生能力。体内谱系追踪实验[38-39]表明，以Prrx1-CreERt和αSMA-CreERt标记的软骨膜细胞可以参与骨折损伤后的修复，并快速生成软骨细胞和成骨细胞。颅面骨的骨缝与软骨膜有些相似，被认为是适合骨骼干细胞存在的微环境。谱系追踪实验[40-41]表明，以Gli1-CreERt2和Prrx1-CreERt标记的骨缝间充质细胞、切牙干细胞等可以促进硬组织的正常更新和再生。Greenblatt团队新近研究[42]证实，大量骨骼干细胞（Cathepsin K阳性细胞）存在于外骨膜处，不仅可形成成骨细胞，而且在骨折后对愈伤组织的形成起重要作用，但这群细胞并不支持造血功能。在生长板顶部存在着一群缓慢分裂的细胞，通常被称为静止区细胞，其高表达甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related peptide，PTHrP）。有研究者[43]推测静息区存在干细胞，可以形成增殖的软骨细胞克隆，并平行于长骨形成方向分泌促分化的细胞因子，这部分假设由在兔体内进行的自体移植组织实验所证实。最近，研究者[44]使用PTHrP-CreERt2谱系追踪实验证实了这一发现，PTHrP阳性软骨细胞长期持续形成柱状软骨细胞，经历肥大过程并成为生长板下方的成骨细胞和骨髓基质细胞。

6 总结

骨骼干细胞成骨向分化是机体骨骼-牙齿等硬组织形成的关键步骤。在生命进程的早期，发育相对活跃；而在成年期，骨骼必须保持多种细胞结构以应对机体变化，从骨小梁的快速更迭到骨皮质的缓慢重建，并在出现裂缝或骨折时进行硬组织修复。因此，在胚胎期的骨髓和软骨膜、新生期的生长板静止区、成年期的骨髓腔和骨膜中都存在多种局部的骨骼干细胞，这些骨骼干细胞具有独特的生物学性质和功能，受局部因素和激素的调节。

本文浅谈了利用目前已知的干细胞表面标志分子和体内谱系追踪等方法来鉴定骨骼干细胞的科研进展。尽管越来越多的研究者关注这一领域，但对于不同骨骼干细胞之间的关系仍了解甚少。值得注意的是，目前了解的骨骼干细胞主要是通过表达一种特异基因的启动子的方式来鉴定的，在体内鉴定出的大多数干细胞群异质性非常大。 因此，今后需要寻找更为准确的在体内鉴定骨骼干细胞的实验方式，并有效地与已阐明的骨骼干细胞标志物相结合，可以为硬组织再生医学以及损伤修复的组织工程应用带来巨大的帮助。