环状非编码RNA在间充质干细胞成骨向分化中作用的研究进展

杨叶青 陈明 吴补领

1.南方医科大学南方医院口腔科 广州 510515；2.南方医科大学口腔医学院 广州 510515

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类特殊的非编码RNA，具有环状结构。与线性RNA相比，circRNA的环状结构可抵抗RNA酶R的消化，因而不易被降解，结构更加稳定[1]。除此之外，circRNA还具有分布广泛、高保守性、组织细胞表达特异性等特征[2-3]。在某些特定情况下，circRNA的表达丰度超过了相关线性信使RNA（messenger RNA，mRNA）丰度的10倍之多。因而circRNA被认为是理想的疾病诊断标志物及治疗靶点，具有非常重要的研究意义及临床应用价值[4-5]。circRNA对干细胞的多向分化及维持细胞的多潜能状态也起着重要的调控作用。在干细胞的分化、免疫和炎症反应中都发现了特异表达的circRNA。不同研究表明，circRNA可调控胚胎干细胞的多能性及分化能力，并且可以诱导多能干细胞的形成。随着对circRNA生物学功能研究的不断深入，发现circRNA在多种复杂疾病的发生、发展过程中可发生特异性表达，这些疾病包括动脉粥样硬化、帕金森病、阿尔茨海默病、肌强直营养不良、糖尿病以及各类肿瘤[6-11]。

间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，取决于局部微环境的刺激，间充质干细胞可产生大量生物活性物质，具有造血支持、提供营养、激活内源性干/祖细胞、组织损伤修复、免疫调节、促进血管新生、抗细胞凋亡、抗氧化、抗纤维化以及归巢等多方面的作用。多种组织和器官中间充质干细胞含量丰富，如骨髓、脂肪、牙髓、脐带和胎盘等[12-13]。已证实间充质干细胞具有成骨向分化特性，但间充质干细胞在成骨向分化过程中的作用机制尚不明确，本文重点介绍了目前研究发现的circRNA在间充质干细胞成骨向分化作用中的机制。

1 circRNA在牙源性间充质干细胞成骨向分化中的作用

牙源性干细胞具有优越的干细胞特性，可以从医疗废弃物（如正畸需要拔除的牙、智齿等）中获得，包括牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙根尖乳头干细胞、牙周膜干细胞以及牙囊前体细胞等[14-15]。Laino等[16]成功在体外使用牙髓干细胞形成新鲜自体骨，将新鲜自体骨植入鼠皮下4周后，其成功改建为板层骨。Amir等[17]的研究表明，犬牙周膜干细胞能够修复直径10 mm以下的颌骨缺损。另有研究[18]发现，脱落乳牙牙髓干细胞在植入免疫缺陷动物后，能在老鼠脑组织中生存和迁移，并且能够在体内产生非板层骨和牙本质样结构。因此，明确牙源性干细胞成骨向分化的调控机制，将有助于进一步优化基于干细胞的组织再生治疗，为实现干细胞治疗的临床应用提供新的依据和思路。Bahn等[19]发现，circRNA可能与口腔环境中的一些炎症性疾病有关。

1.1 在牙周膜干细胞成骨向分化中的作用

张雄等[20]研究发现，circRNA8433在人牙周膜干细胞成骨向诱导21 d后显著高表达，将来可能是人牙周膜干细胞成骨向分化新的生物学标志物。Zheng等[21]用牙周膜干细胞矿化诱导3 d时发现，与未诱导细胞相比，共有118个circRNA存在差异表达；7 d时共有128个circRNA存在差异表达；14 d时有139个circRNA存在差异表达。在所有样品中，仅约4%的circRNA以时间方式改变，同时动态表达在牙周膜干细胞的成骨向分化和生物矿化过程中，表明circRNA可能在细胞成骨向分化和骨形成中起作用。差异表达的circRNA富集在细胞质或膜结合的囊泡和细胞外基质中，表明它们在调节细胞外囊泡的生物发生中的潜在作用。

Gu等[22]发现牙周膜干细胞经矿化诱导后，总共检测到147个长链非编码RNA、1 382个circRNA与148个常见微小RNA（microRNA，miRNA，miR）组合，并与744个mRNA竞争miRNA结合位点。预测这些mRNA参与了细胞成骨向分化、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径、Wnt途径和调节干细胞多能性的信号传导途径。基于miRanda预测，其中circRNA BANP和circRNA ITCH可能与miR-34a和miR-146a相互作用，通过MAPK途径调节牙周膜干细胞成骨向分化。

近期研究[23]发现，机械加力组牙周膜干细胞与未加力对照组相比，2 678个circRNA差异表达，1 191个上调，1 487个下调。其中circRNA3140与miR-21高度广泛相关，miR-21在机械力诱导的牙周膜干细胞成骨向分化中起关键作用。机械加力后的牙周膜干细胞中显著下调的circRNA436与miR-107和miR-335都相关，而miR-107和miR-335与Wnt/β-连环蛋白信号通路相关，表明circRNA436可能是机械力刺激下牙周膜干细胞分化的关键调节因子之一；同时，根据基因本体论（gene ontology，GO）分析可知，差异表达的circRNA4004与细胞外囊泡外泌体有关，它提供了外胚层介导的骨组织工程成骨向分化模式[24-25]。差异表达的circRNA4214参与了转化生长因子β信号通路调控MAPK信号通路。众所周知，MAPK信号通路有利于成骨细胞的增殖和分化。GO分析显示，circ-RNA3140与Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）信号通路和核因子（nuclear factor，NF）-κB信号通路相关。TLR可通过激活NF-κB途径影响人间充质基质细胞的成骨潜能，并介导牙周膜干细胞在脂多糖诱导的炎症微环境中的成骨向分化[26-28]。通过预测软件分析可知，circRNA5331表现出与miR-204高度相关。2010年Huang等[29]已经阐明miR-204可通过负调节Runt2来抑制间充质祖细胞和骨髓基质细胞的成骨。Wang等[23]继续根据网络图预测可知，circRNA126、circRNA4045和circ-RNA4251可以分别与多种miRNA（包括miR-101、miR-335和miR-107）相互作用。而Wang等[30]和Zhang等[31]曾报道miR-101和miR-335通过靶向Wnt/β-连环蛋白信号通路来调节间充质干细胞的成骨向分化。

目前关于circRNA在牙周膜干细胞成骨向分化方面的研究主要集中在基因芯片和生物信息学分析水平，但也有少量研究进行了机制方面的探讨，内源性竞争RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA）代表一种全新的基因表达调控模式，比miRNA调控网络更为精细和复杂，涉及更多RNA分子（包括mRNA、miRNA和circRNA等）。Li等[32]检测了成骨诱导期间牙周膜干细胞中circRNA CDR1as和miR-7的动态表达谱。在成骨诱导期间，CDR1as的表达逐渐上调，14 d后，其表达比初始水平高10倍以上；miR-7的表达在牙周膜干细胞中显著下调。CDR1as的低表达和miR-7的过表达抑制了碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、茜素红S染色和成骨基因的表达。miR-7的过表达显著降低了含有生长分化因子（growth/differentiation factor，GDF）5的野生型而非突变体3"非翻译区序列的荧光素酶报告载体的活性。GDF5的下调部分逆转了miR-7抑制剂对成骨细胞分化的影响。随后CDR1as或GDF5的下调抑制Smad1/5/8和p38促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，而miR-7的上调降低磷酸化Smad1/5/8和p38 MAPK的水平。因此牙周膜干细胞circRNA CDR1as可充当miR-7抑制剂，引发GDF5的上调和随后的Smad1/5/8和p38 MAPK磷酸化，以促进牙周膜干细胞的成骨向分化。

综上，circRNA在牙周膜干细胞分化过程中的调控机制以及调控的多条途径之间的关联可能成为今后的研究热点。

1.2 在牙乳头干细胞成骨向分化中的作用

占云燕等[33]发现在经矿化诱导的小鼠牙乳头细胞中，获得了4 064个差异表达的circRNA，其中上调的共3 255个，下调的共904个。对上调circRNA来源基因进行分析，发现其中很多基因与牙的发育过程及硬组织矿化相关，其中Ipo7与Smad1的核转位有关。Smad1为牙发育过程中起重要作用的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）通路的效应分子，circRNA在成牙本质细胞发育过程中有重要的调控作用。Setd2与组蛋白功能有关，在骨的重建中发挥重要作用。

新近研究[34]发现，根尖牙乳头细胞在经矿化诱导后，共有650个circRNA的表达显著改变，其中317个circRNA下调，333个circRNA上调。通过京都基因与基因组百科全书KEGG和GO分析差异表达的基因，这些差异表达基因大多涉及Wnt信号通路、MAPK信号通路和其他一些与成骨相关的信号通路。随后建立了成骨相关ceRNA网络，选出其中的circRNA NTATC1利用实验验证，证明其可促进牙根尖乳头干细胞的成骨向分化；同时也发现miR-4483的表达与circRNA NFATC1的趋势呈负相关；利用circRNA数据库circBase预测到miR-4483与circRNA NFATC1有结合位点，为牙根尖乳头干细胞的成骨向分化提供了新的见解。

目前关于circRNA在牙乳头干细胞成骨向分化中的功能及机制的探讨较少，尚停留在小鼠模型研究及基因芯片和生物信息学分析水平，相信伴随着新的研究技术体系的建立，circRNA在牙乳头干细胞成骨向分化中的机制将进一步阐明。

2 circRNA在非牙源性间充质干细胞成骨向分化中的作用

2.1 在骨髓间充质干细胞成骨向分化中的作用

目前对非牙源性间充质干细胞在成骨向分化中circRNA的功能研究大多集中在骨髓来源的细胞，多为在骨质疏松方面的功能及作用。

Li等[35]发现雌激素受体（estrogen receptor，ER）β缺乏会抑制骨髓间充质干细胞的成骨向分化。沉默ERβ会使骨髓间充质干细胞中的一些circRNA差异表达，并且成骨相关蛋白质在mRNA和蛋白质水平的表达下调。通过RNA-Seq分析检测ERβ对circRNA表达的影响，146个circRNA存在差异表达，68个circRNA下调，78个circRNA上调。构建circRNA-microRNA网络表明，ERβ可以通过2:27713879|27755789/2:240822115|240867796-miR-328-5p-mRNA网络来调节成骨向分化。随后相继有学者发现circRNA在骨髓间充质干细胞成骨向分化中有重要的作用，Zhang等[36]发现在骨髓间充质干细胞成骨向分化期间，与未分化细胞相比，第7 d时总共有3 938个circRNA上调，150个circRNA下调；大约95%的差异表达的circRNA来自编码蛋白质的基因，GO分析表明差异表达的circRNA的亲本基因与成骨存在关联；其中一些circRNA与具有成骨作用的miRNA存在关联，表明这些circRNA可能在骨髓间充质干细胞的成骨向分化中起作用。circRNA IGSF11的沉默促进了成骨细胞分化并提高了miR-199b-5p的表达水平，证明了circRNA-miRNA相互作用对人骨髓间充质干细胞的成骨向分化有积极作用。赵可伟[37]通过circ-RNA芯片检测绝经后骨质疏松症患者外周血单核细胞中circRNA的表达水平，检测到11 246个circ-RNA；绝经后骨质疏松症组与非患病对照组相比，381个circRNA表达变化倍数≥1.5（P<0.05），其中203个上调、178个下调；其中circRNA0001275具有作为绝经后骨质疏松症生物标志物的潜能。研究结果证明了circRNA在骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中发挥调控作用。在防治骨质疏松症方面，Yin等[38]也发现在人骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中，circRNA RUNX2（circRUNX2）可以与miR-203结合并增强RUNX2的表达，抑制成骨向分化，因此证明circRUNX2可预防骨质疏松症。

Yang等[39]发现，与非骨质疏松症患者相比，骨质疏松症患者血清中miR-217水平升高，血清circRNA VANGL1和RUNX2水平降低。circRNA VANGL1（circ-VANGL1）通过吸收miR-217来调节RUNX2表达，而加速成骨向分化。circ-VANGL1的过表达使与成骨相关的RUNX2、骨桥蛋白、骨涎蛋白、骨钙蛋白的表达上调。同时，过表达circ-VANGL1的骨髓间充质干细胞中ALP活性增加。共同过表达circ-VANGL1和miR-217的骨髓间充质干细胞中的ALP活性略微增加。Ren等[40]发现降钙素基因相关肽（calcium gene-related peptide，CGRP）刺激骨髓间充质干细胞后，有58个显著差异表达的circRNA，其中44个circRNA下调，14个circRNA上调；其中mmu_circRNA_003795显著增加，而沉默mmu_circRNA_003795后，mmu_miR-504-3p的表达增加，Fos样抗原2表达和细胞增殖减少。上述结果证明了circRNA在CGRP诱导的骨髓间充质干细胞增殖中有重要作用，确定circRNA涉及调节机制的部分，进一步提供了研究骨髓间充质干细胞成骨向分化及增殖的能力的新方向。

2.2 在胚胎间充质干细胞成骨向分化中的作用

Qian等[41]通过RNA-seq分析不同成骨细胞分化阶段circRNA的差异表达，鉴定circRNA19142和circRNA5846与成骨细胞分化有关，BMP2可通过circRNA9142/circRNA5846诱导小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1158细胞的成骨向分化。

2.3 在脂肪间充质干细胞成骨向分化中的作用

Long等[42]发现小鼠脂肪间充质干细胞成骨过程中不同阶段存在差异circRNA表达，共检测到14 236个circRNA，其中有40个上调，circRNA通过干扰成骨相关的miRNA在成骨向分化中发挥重要作用；circRNA-miRNA共表达网络显示miR-338-3p与上调的circRNA13422及circRNA22566相关。circRNA表达谱数据对脂肪来源干细胞成骨向分化期间circRNA功能的确定有重要的价值。

3 circRNA在间充质干细胞成骨向分化中的作用研究展望

综上所述，虽然目前涉及circRNA对间充质干细胞成骨向分化方面的文献较少，研究方法主要集中在基因芯片检测以及生物信息学分析的层次上，对其相互作用的机制研究仍然欠缺，许多circRNA的生物学功能尚未得到阐明。从本文所述中可以看出，间充质干细胞的成骨向分化会受到circRNA的调控，兼有抑制或促进效应；少量的机制研究中发现，circRNA与miRNA和mRNA关系密切，彼此相互作用，在人体内构成一个复杂而精准的网络调控体系，可能构成了近年来探讨较多的ceRNA的作用机制，circRNA可以结合某些miRNA以发挥分子海绵作用，调控宿主的基因表达[43]。关于circRNA对间充质干细胞成骨向分化的相关调控因素作用方面的研究有助于深入探究circRNA这一重要的非编码RNA，也将有利于为间充质干细胞的再生治疗提供新的思路和方法。