生长因子诱导间充质干细胞三维体外软骨形成的研究进展

朱明静 张清彬

广州医科大学附属口腔医院颞下颌关节科，广州口腔疾病研究所，口腔医学重点实验室 广州 510140

关节软骨缺损可能是创伤性、退行性疾病或是全身免疫性疾病的结果，常常导致关节炎和退行性功能逐渐丧失，影响全世界数百万人[1-2]。成人关节软骨显示出较差的自我修复能力，而且创伤后关节软骨的愈合能力有限[3]。临床研究[4]已经探索了各种促进软骨修复的方法，如磨损关节成形术、微骨折软骨成形术、骨膜移植、自体软骨细胞移植、骨软骨移植和嵌入式胶原基质。

目前不同来源的间充质干细胞已被研究，甚至应用于临床。由于其优异的增殖及向骨、软骨、肌肉等的分化能力[5]，间充质干细胞是用于再生医学较有吸引力的细胞来源。间充质干细胞存在于各种组织中，例如骨髓、脂肪组织、肌肉、肝脏、真皮、滑膜组织等。基于此，间充质干细胞有望用于软骨修复[2]。然而，需要发现更多可重复一致的方法以有效诱导这些干细胞系中软骨的形成。在这些干细胞系中诱导软骨形成的方法包括合适的颗粒/基质组合物、软骨分化培养基、低氧张力和其他一些形式的机械负荷[6-7]。

本综述将重点介绍可溶性生长因子对间充质干细胞的三维体外软骨诱导作用，尤其是转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β超家族[3]，其中包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，以及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和BMP-9。同时，还有其他生长因子，包括成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）-2、糖皮质激素（glucocorticoid，GC）和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）-1[8]。

1 间充质干细胞

间充质干细胞是一种多能干细胞，能够分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞和肌原细胞[3]。Bernardo等[9]首先在间充质干细胞中观察到软骨形成。Steadman等[10]首先描述了间充质干细胞的体外软骨形成确定的培养基。此外，已显示这些细胞在骨和软骨稳态中起作用。因此，基于体外观察，间充质干细胞可分化为成软骨细胞并且易于增殖和获得，这些细胞被视为软骨工程中较有吸引力的候选者。

间充质干细胞最初可以从骨髓或其他组织分离[11]。在妊娠早期和妊娠中期的胎儿组织（例如肺、骨髓、肝和脾）中已鉴定出间充质干细胞。在自体细胞疗法中，由于易获得和潜在的自体应用，骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell）和脂肪组织来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cell）成为间充质干细胞的主要来源。许多研究表明，骨髓来源的间充质干细胞与脂肪组织来源的间充质干细胞具有相似的特征，包括形态学和细胞表面标志物，但已发现其生长和分化能力存在显著的生物学差异，特别是在控制间充质干细胞分化和增殖的重要因素表观遗传调节机制方面。

到目前为止，DNA甲基化和组蛋白修饰是最重要的表观遗传调控方式，具有控制分化或维持间充质干细胞自我更新的能力。已知在启动子区或第一外显子中，CpG岛的甲基化状态的变化与相应基因的表达成反比。与胚胎干细胞和分化细胞中的二价位点不同，骨髓间充质干细胞中的二价位点DNA甲基化程度通常较低，可以进一步甲基化或活化。Trip10启动子内的靶向DNA甲基化已被证明可加速间充质干细胞向神经元或骨细胞分化。Xu等[12]确定了间充质干细胞命运的表观调节作用，其研究结果显示，从骨髓或脂肪组织获得的表观遗传记忆有利于间充质干细胞沿成骨细胞或脂肪细胞谱系分化。在骨髓来源的间充质干细胞中，Runt相关转化因子（Runt-related transcription factor，Runx）2启动子的CpG位点呈低甲基化状态，而在脂肪组织来源的间充质干细胞中呈高甲基化状态。在脂肪组织来源的间充质干细胞中，过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）γ启动子的CpG位点呈低甲基化状态，而在骨髓来源的间充质干细胞中呈高甲基化状态。在骨髓来源的间充质干细胞中，SOX（SRY-related high mobility group-box gene）-9启动子的甲基化状态仅略低于脂肪组织来源的间充质干细胞。故控制间充质干细胞命运的主要转录因子的甲基化状态有助于不同来源的间充质干细胞的差异分化能力。

口腔来源的牙源性间充质干细胞（dentalderived mesemchyal stem cell）有牙髓干细胞（dental pulp stem cell）、脱落乳牙干细胞（stem cell from exfoliated deciduous teeth）、牙周韧带干细胞（periodontal ligament stem cell）、根尖乳头干细胞（stem cell from apical papilla）和牙滤泡祖细胞（dental follicle progenitor cell）。牙组织是特殊的组织，不像骨组织那样持续重塑。因此，与骨髓来源的间充质干细胞相比，源自牙组织的干细胞/祖细胞的分化潜能可能更高。牙髓干细胞较多与支架材料（如水凝胶、壳聚糖/藻酸盐等）结合用于软骨向分化[13-14]。同时，牙髓干细胞在体外有与骨髓来源的间充质干细胞共享相似的蛋白质表达模式，但成软骨形成潜能很弱；相反，牙源干细胞的神经源性可能比骨髓来源的间充质干细胞更有力，这很可能与它们的神经鞘起源有关。脱落乳牙干细胞成软骨也得到证明，但在成骨和表达神经元和神经胶质细胞标记方面能力较弱。其余类型细胞也在成骨、成纤维等方面能力较强[14]。

2 生长因子

来自软骨组织工程的可溶性因子可以通过设定低水平的TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IGF-1和高水平的IGF-2、FGF-2、FGF-4在成软骨培养基中独立地诱导间充质干细胞成软骨向分化[15]。

TGF-β超家族的大多数成员在软骨组织中表达，并可能影响软骨形成和生长的骨骼组织发生。TGF-β在体外可促进在早期未分化的间充质干细胞培养物中形成软骨，并在体内刺激成软骨向分化。TGF-β还刺激胶原合成和成骨细胞样细胞的趋化性，并促进体内神经支配后软组织伤口的愈合。TGF-β在骨折修复的所有阶段均表达，外源性TGF-β在骨修复过程中对基因表达以及软骨和骨细胞的分化具有显著影响[16]。

IGF-1被认为是影响软骨发育、增长和体内平衡的关键因素之一。IGF-1水平的降低可能因关节炎时软骨细胞募集减少而导致严重的骨关节炎。一些研究表明，IGF-1在三维基质或微团培养物中维持分化的骨间充质细胞和骨膜细胞的分化表型和软骨形成能力的同时，增强了软骨细胞的代谢。同时体外研究[17]也表明，IGF-1可在独立于TGF-β的情况下诱导成软骨向分化，但分化潜能稍弱于后者。

在FGF类家族成员中，FGF-2较多用于保持TGF-β1/BMP-2对间充质干细胞成软骨分化潜能的协同作用，并减少不需要的肥大标志物[8]。TGF-β和BMP已被证实在诱导软骨形成中起重要作用[18]。

然而，尽管这些生长因子对软骨再生具有很大的治疗潜力，但其在临床治疗中存在一些并发症，而且剂量要求高、半衰期短、蛋白质结构不稳定、使用成本高，以及存在形成肥大物质和炎症因子等不良反应[19-21]。生长因子间的协同作用可适当减少并发症的发生[4]。

3 三维培养体系

三维颗粒/基质培养体系被认为是成软骨分化的重要方面[22-23]。据报道，在二维单层中培养的人间充质干细胞（human-derived mesenchymal stem cell）和人脂肪干细胞（human-derived adipose stem cell）相较于在三维基质或沉淀物培养条件下软骨形成减少。据认为，细胞的沉淀或基质提供了一种与胚胎发育过程中软骨前凝固相似的环境，在此过程中细胞呈球形[15,24-25]。颗粒系统最初用于预防软骨细胞的表型调控和研究生长板软骨细胞的终末分化。最常报道的粒径范围为包含2×105～2.5×105个细胞，但也有报道[26]可高达包含5×105个细胞。

基于基质的系统通常包括藻酸盐和琼脂糖。这些凝胶不能长时间稳定地支持人间充质干细胞。据报道，在存在TGF-β3的情况下，人间充质干细胞接种的藻酸盐珠构建体导致人间充质干细胞上调Ⅹ型胶原。相反，通过离心将人间充质干细胞转化为沉淀，孵育于合并TGF-β3和地塞米松的环境中，未检测到Ⅹ型胶原的上调。

Zhang等[27]在间充质干细胞软骨形成过程中，证明了微团培养体系比标准的颗粒培养体系更有效。此外，间充质干细胞在微团培养条件下，在成软骨向分化过程中上调了Ⅹ型胶原和Ⅰ型胶原的表达，表明诱导的软骨更类似于透明软骨。这些发现表明，微团培养系统是研究人间充质干细胞中软骨形成潜力的有前景的工具。然而，单独的三维培养环境不能维持延长软骨形成。生长因子和适当的物理刺激是诱导和防止软骨细胞继续分化为肥大细胞所必需的。

4 间充质干细胞成软骨向分化中的生长因子

4.1 TGF-β在间充质干细胞成软骨向分化中的作用

TGF-β是一种多功能肽。已证明生长因子家族的成员在骨和软骨发育中发挥重要作用[20]。TGF-β超家族的成员对于恢复和维持软骨形成表型以及诱导来自不同来源的间充质干细胞的成软骨向分化特别重要[28-30]。TGF-β亚型对软骨细胞和其他细胞有不同的影响。

TGF-β3是目前被公认在成软骨分化中较有效的生长因子[31]。Renner等[32]认为TGF-β3是一种有效的软骨形成诱导剂。在早期人间充质干细胞形成软骨的培养基配方中，TGF-β3便是组成成分，并且显示出比TGF-β1更强烈的促进基质产生的作用。在生长因子TGF-β家族成员中，TGF-β2和TGF-β3在促进软骨形成方面比TGF-β1更有效，导致更早和更广泛的糖胺聚糖累积以及Ⅱ型胶原沉积[20,33]。而Goessler等[34]证明，在软骨细胞去分化中，TGF-β1连续表达，而TGF-β2从未表达。TGF-β受体（TGF-β receptor，TGF-βR）Ⅲ连续表达，而TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ从未表达。然而，软骨细胞外基质的许多沉积成分是通过暴露于TGF-β3的间充质干细胞而形成的，包括聚集蛋白聚糖、连接蛋白、纤维调节素、软骨寡聚基质蛋白、核心蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和软骨粘合素。软骨细胞和其他几种类型细胞产生TGF-β，作为与潜在的同型二聚体和潜在的TGF-β结合蛋白（latent transforming growth factor beta binding protein，LTBP）相关的大分子。

在生长板软骨细胞中，LTBP对TGF-β的储存具有细胞成熟依赖性。已知LTBP有4种不同的型，即LTBP-1、LTBP-2、LTBP-3和LTBP-4。编码LTBP-1和LTBP-2的基因通过连续去分化激活，而编码LTBP-3的基因连续表达，并且获得编码LTBP-4基因的阴性表达结果。

在软骨形成分化过程中，间充质干细胞连续表达TGF- β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β4，而LTBP-1，LTBP-2表达下调。但是，Goessler等[34]的研究表明，TGF-β3、TGF-β4、TGF-β1、LTBP-1和LTBP-2可能有助于去分化过程，而TGF-β1和TGF-β2可能不参与这一过程。在TGF-βR中，只有TGF-βRⅢ可能参与去分化[33]。

4.2 BMP在间充质干细胞成软骨向分化中的作用

BMP被认为是诱导间充质干细胞成软骨向分化的生长因子。一些报道通过免疫组织化学和合成软骨的大小和重量检测说明了BMP对成软骨向分化的影响。在已经鉴定出的20种哺乳动物的BMP中，仅显示3种Ⅰ型和3种Ⅱ型受体与BMP结合。结合BMP，导致Ⅰ型和Ⅱ型受体在磷酸化之前发生二聚化，并通过Smad通路发出信号[18]。BMP调节软骨和骨骼发育的各个阶段。特别是在软骨中，BMP参与软骨形成的所有阶段，其直接调节几种软骨细胞特异性基因的表达，并且对软骨细胞增殖和基质合成具有强烈影响。BMP已被证明是软骨和骨骼发育的关键调节因子，也在成人骨骼系统的修复和重塑中发挥作用[35]。

研究者[36-37]通过比较BMP-2、BMP-4以及BMP-6对间充质干细胞体外软骨形成的影响，首次证明BMP-2在促进软骨形成方面比BMP-6更有效。通过对近12 000个基因的微阵列分析和逆转录聚合酶链反应分析，确定在预期BMP-2的反应时间序列中有软骨合成的关键基因表达。BMP-2被认为是体外培养人骨髓间充质干细胞的一种强有力的软骨形成剂，并在体内促进关节软骨愈合[32]。

Majundar等[38]证明，BMP-2和BMP-9诱导了Ⅱ型胶原mRNA的表达，增加了聚集蛋白聚糖和软骨寡聚基质蛋白的表达，这就提示了软骨细胞分化。在使用BMP治疗过程中，Ⅱ型胶原α1、聚集蛋白聚糖及SOX-9表达的转录因子表达增加。经白细胞介素（interleukin ，IL）-1处理后，软骨分化细胞SOX-9、Ⅱ型胶原α1和聚集蛋白聚糖的表达下降。去除IL-1并进一步添加BMP，可恢复软骨细胞标志物的表达。

Renner等[32]研究了一种BMP衍生的短肽，它能促进少量胶原蛋白的生成，并在与BMP-2类似的水平上促进人间充质干细胞中糖胺聚糖的生成。与BMP-2不同的是，该BMP衍生肽促进基质积累，而不引起肥大标志物的广泛上调，这使得该BMP衍生肽成为软骨工程中分化人间充质干细胞的一个有价值的工具[39]。

4.3 其他生长因子在间充质干细胞成软骨向分化中的作用

FGF参与血管生成和组织修复。有研究[38,40-41]比较了在补充和不补充FGF的情况下人间充质干细胞增殖的速率、沿着软骨形成途径体外分化的能力，以及基因表达谱系。在补充FGF的培养基中，增殖的人间充质干细胞比在对照条件下增殖的人间充质干细胞更小并且增殖更快。用FGF处理的细胞制备的软骨形成培养物比用对照细胞制备的培养物更大并且含有更多的蛋白多糖。

FGF-2也被称为碱性成纤维细胞生长因子，已用于许多祖细胞培养系统中以刺激增殖。FGF-2在维持胚胎自我更新能力中起重要作用。新近研究[42]的结果表明，FGF-2对软骨形成和软骨缺损的修复具有特定的有益作用。Solchaga等[43]用含FGF-2的培养基培养间充质干细胞，发现不仅增加了增殖速度，而且还成功地延迟了软骨形成的丧失。

维生素D是一组脂溶性类固醇，负责增加肠道对钙、镁和磷酸盐的吸收，以及具有其他生物效应。维生素D与维生素D受体的相互作用是骨代谢和钙稳态的关键介质，同时显著促进细胞分化和抑制细胞增殖。维生素D可以促进间充质干细胞增殖、移植和软骨分化[44-46]。

糖皮质激素已被证明可促进成骨细胞和软骨细胞的分化，是人间充质干细胞软骨形成和成骨分化所必需的[47]。这些观察结果表明，生理性糖皮质激素可能参与体内软骨细胞的增殖和分化，并且糖皮质激素可通过作用于成体间充质祖细胞而影响体内的骨骼功能。但是，糖皮质激素在这一过程中的确切作用机制尚不清楚。Derfoul等[48]研究了在存在或不存在地塞米松、TGF-β或地塞米松+TGF-β的情况下，地塞米松对人间充质干细胞软骨形成和分化的影响，结果表明，糖皮质激素是成人间充质干细胞中软骨形成分化的关键调节因子。

4.4 生长因子在软骨形成过程中的相互作用

在软骨内骨化过程中，BMP和TGF-β信号通路可以在体内拮抗软骨细胞的增殖和分化。在ATDC5细胞软骨形成中，TGF-β能够增强BMP信号传导，而BMP-2能够显著降低TGF-β信号传导。间充质干细胞也是如此[37]。

通过循环加入生长因子以诱导间充质干细胞软骨形成和分化的循环模式是用于组织工程细胞诱导的有效方式。Indrawattana等[49]结合生长因子TGF-β3和BMP-6或TGF-β3和IGF-1，证明了它们对于诱导软骨形成更有效，表明BMP-6和IGF-1信号传导可以增强TGF-β3诱导的间充质干细胞软骨的形成。

此外，Fukumoto等[50]的研究表明，IGF-1和TGF-β1组合可以起作用，调节骨软骨细胞增殖和分化过程中骨膜间充质细胞的变化。TGF-β1早期起作用诱导软骨形成，而IGF-1增强并维持增殖，增加软骨的整体形成。

Renner等[32]观察到，当BMP-2与TGF-β3组合时，软骨形成或协同反应增强。TGF-β1还可通过调节ERK/JNK途径参与维生素D诱导的骨髓来源的间充质干细胞成软骨向变化。

Hara等[51]发现醋酸氟轻松与TGF-β3结合并强烈增强人骨髓间充质干细胞的成软骨向分化。结果显示醋酸氟轻松具有增强TGF-β3相关软骨形成的独特能力，并且醋酸氟轻松/TGF-β3组合可用作体外软骨形成的主要诱导物。此外，醋酸氟轻松/TGF-β3有可能用于临床，以提高基于干细胞的成软骨向分化的再生方法的效率。

5 结语

为了开发诱导间充质干细胞形成软骨的可再现方法，有必要分析增殖培养基、颗粒/基质组合物、软骨分化培养基、氧张力和适当的机械环境。

本综述着重于成软骨向分化培养基中的一个组成部分可溶性诱导生长因子，以分析对已知不同生长因子在间充质干细胞中诱导软骨形成作用的理解。

研究结果已显示，三维颗粒/基质系统在间充质干细胞成软骨向分化中起重要作用。分析TGF-β超家族的表达级联将极大地帮助确定各种生长因子影响间充质干细胞基因表达的机制。然而，这些序列的复杂性要求目前研究采用钝性方法进行软骨形成。因此，比较生长因子组合的系统是确定如何在这些干细胞中始终如一地和最佳地诱导软骨形成的关键。生长因子可以单独诱导特定的特征，它们结合起来可能促进和/或抑制其他的特征。

此外，还关注到已知的生长激素用于成软骨向分化培养基以诱导间充质干细胞软骨形成，似乎较有效诱导间充质干细胞中形成软骨的因子包括地塞米松、TGF-β3、BMP-2、BMP-6和FGF。鉴于此，TGF-β超家族的其他成员诱导软骨形成的事实表明，它们在一定程度上也可以发挥软骨形成作用。