Fmoc-Gla(OtBu)2-OH合成方法的研究进展

梁佩芳

（开封大学医学部,河南开封475001）

Gla 在肽类与蛋白质合成中起着非常重要的作用。若要合成含有Gla 的多肽及蛋白质，Gla 是必不可少的。但是Gla 为非天然氨基酸，含有手性中心，且用于固相合成芋螺睡眠肽类似物的γ,γ′-二叔丁基-L-Nα-9-芴甲氧羰基-γ-羧基谷氨酸（Fmoc-Gla(OtBu)2-OH）含有多个保护基，故难以合成。近年来，国内外对Fmoc-Gla(OtBu)2-OH 的合成方法做了大量的研究，推出了许多合成路线。根据起始原料的不同有四条合成路线，现综述如下。

1 以安息香酸为原料合成目标产物

1995 年，Schuerman MA 提出用廉价的安息香为原料合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH[1]，合成路线如下：

图1 以安息香为原料合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH

合成路线：以安息香为原料，先将安息香转化为安息香肟（3），再通过钯碳催化剂催化氢化还原，生成L型（4a）和D型（4b）的氨基醇外消旋体，通过加入天然氨基酸——L-谷氨酸进行拆分，得到L-氨基醇（4a）中间体，中间体加入溴乙酸乙酯反应生成缩醛，苄氧羰基（Cbz）保护氨基，得到（5）。经历开环（6），氯化钯催化氢化脱保护得到（7），芴甲氧羰基（Fmoc）保护氨基得到最终产物（1）。反应总产率为8.44%。

该方法的优点：反应起始原料安息香价格便宜，供应充足；分旋光试剂为天然氨基酸——L-谷氨酸，便宜易得；纯化方法简单，路线中所有纯化步骤仅需重结晶纯化；不需柱层析纯化。缺点：用谷氨酸作为分旋光试剂，可能导致产物光学纯度低，需要多次分离，且产生大量的D 型中间体（目前没有合适的用途），导致产率下降；催化氢化所用氯化钯催化剂价格昂贵，且长时间的加压氢化对工业设备有较高要求；由于多数步骤反应产率较低，导致总产率较低。

2 以Z-对苯磺酰基-丝氨酸甲酯为原料合成目标产物

1997 年，Somla S 提出以Z-对苯磺酰基-丝氨酸甲酯（Z-Ser(Tos)-OMe）为原料，合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH[3]。2006 年，军事医学科学院戴秋云研究员课题组的肖彩又对其路线进行优化[4]，合成路线如下:

图2 以Z-Ser(Tos)-OMe为原料合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH

合成路线：丙二酸二叔丁酯与正丁基锂反应，生成带有碳负离子的中间体，再与Z-Ser(Tos)-OMe 反应，生成中间体（9），（9）在碱性条件下水解得到外消旋体（10），在（10）的乙酸乙酯溶液中加入奎宁，低温放置一段时间，D型异构体结合奎宁沉淀，蒸干溶液，得到L型异构体（11），（11）用钯碳催化剂催化氢化脱去Cbz保护基，再经过Fmoc保护氨基得到最终产物（1）。

该方法的优点：合成路线短，仅需5 步反应便能得到目标产物，且除了第一步反应，其余反应均相对简单，各步反应时间短，路线周期短，适合实验室少量合成Fmoc-Gla(OtBu)2-COOH。缺点：相比于其他方法，原料Z-Ser(Tos)-OMe的价格相对昂贵；选用奎宁为分旋光试剂可能导致产物光学纯度低，且需要多次分离，分离后的D型中间体目前没有合适的用途。

3 以D-丝氨酸为原料合成目标产物

2006 年，Jiang S 提出以D-丝氨酸（D-Ser）为原料，先合成重要中间体Garner 醛[5]，再合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH[6]，合成路线如下：

图3 以D-Ser为原料合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH

合成路线：以D-Ser 为原料，加入无水甲醇和乙酰氯，酯化生成（13），再与氯甲酸苄酯（Cbz-Cl）反应，Cbz保护氨基，生成（14），环化，硼氢化钠还原酯基为羟基，氧化羟基为醛基，生成重要的中间体——Garner 醛（17），丙二酸二叔丁酯与正丁基锂反应，生成碳负离子中间体，再与Garner 醛反应生成（18），溴化铋催化缩醛的开环反应，得到（19），重铬酸吡啶鎓（PDC）将羟基氧化为酸，得到（20），再经过钯碳催化氢化还原，脱掉Cbz保护基，Fmoc保护氨基得到最终产物（1）。

该方法的优点：使用D-Ser为原料，价格便宜；合成路线中不涉及手性碳原子的翻转，不会产生D 型中间体，产物光学纯度高，文献记载对映体过量值（enantio⁃meric excess 简称ee 值）可达99%；Garner 醛作为重要中间体，其合成方法较完善；合成步骤的每一步产率均较高，因此总产率高达52%，远远大于其他几条路线产率。缺点：此合成路线周期长，其中一些步骤反应时间长，使得整个路线周期较长；路线中多处使用乙醚、甲苯溶剂，不利于工业生产；反应路线中有些步骤使用混合溶剂，不利于溶剂回收；反应中使用大量PDC 生成铬离子，会对环境造成污染。

4 以硫代水杨酸为原料合成目标产物

2011 年，Smith DJ 提出以硫代水杨酸为原料，合成Fmoc-Gla(OtBu)2-COOH[2]，合成路线如下：

图4 以硫代水杨酸为原料合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH

合成路线：以硫代水杨酸为原料，首先原料与碘甲烷反应，对巯基进行保护，再用氢化锂铝将羧基还原，得到中间体（24），（24）与稀盐酸反应，得到卤代物（25），（25）和脯氨酸、对甲基苯磺酰氯（MsCl）反应得到（27），（27）为外消旋体，其D 型和L 型异构体分别与Cu2+结合后，生成颜色和极性均不相同的（28），此时可用柱层析的方法将二者分离，得到L 型中间体（29），加入稀盐酸脱去脯氨酸，乙二胺四乙酸（EDTA）脱去中间体中的金属离子，Fmoc保护氨基得到最终产物（1）。反应总产率为7.5%。

该方法的优点：创新性地使用二价金属离子——Cu2+，分别与D 型和L 型的反应中间体结合，进行分离，避免了因使用天然氨基酸、麻黄碱、金鸡纳生物碱等分离，导致产物光学纯度低的缺点；原料硫代水杨酸价格便宜，供应充足。缺点：此合成路线长，产率低；中间体（28）的D 型化合物目前没有合适的用途，导致产率下降；化合物（26）（27）（28）（30）（1）均需柱层析法进行纯化，不利于工业生产。

5 结论

文中四种合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH 的路线各有利弊。从工业生产的角度考虑，前三种路线均有明显的缺点，不适合工业生产。以安息香为原料的路线产率低，成本高，难以得到光学纯度高的产物，对设备的要求较高；以硫代水杨酸为原料的路线难以纯化，需要多次柱层析分离；以Z-对苯磺酰基-丝氨酸甲酯为原料的路线成本高，且难以得到光学纯度高的产物。而第四条路线——以D-丝氨酸为原料虽然路线长，周期长，但相对另外三条路线，由于不需要分离旋光异构体，因而产率高，产物光学纯度高，纯化方便，成本低，比较适合工业生产。各条路线比较如表1所示。

表1 四种合成路线比较

以D-Ser为原料的合成路线相比其他三条路线，具有优势，但仍然存在缺点，如在路线中使用混合溶剂会导致溶剂难以重复利用，柱层析纯化不利于批量生产，原料及催化剂的量未经实验探索可能导致浪费或产率下降等。这些缺点使得该路线无法用于工业生产中，必须进行优化改进，优化混合溶剂为单一溶剂，优化柱层析纯化为重结晶纯化，优化反应物配比。只有进行这些优化，才能节省成本，提高产率，才能使Fmoc-Gla(OtBu)2-OH工业化生产得以进行。