丙氨酰谷氨酰胺注射液四肽降解杂质的测定

杨 廷，杨 科，施务务

（1.蚌埠丰原医药科技发展有限公司,安徽蚌埠233010；2.蚌埠市第一人民医院,安徽蚌埠233000）

丙氨酰谷氨酰胺注射液是一类肠外营养药物，广泛用于脏器移植、肿瘤、严重感染、烧伤、创伤、中大型手术后等处于应急状态的病人。本品临床上单次常用剂量为100mL，相当于丙氨酰谷氨酰胺20g，剂量较大。另外，由于肽类药物的特殊性质，其在生产和储存过程中，容易形成各种工艺杂质和降解杂质，增加毒副作用[1-3]。因此，从用药安全性的角度考虑，本品杂质控制尤为重要。研究显示，丙氨酰谷氨酰胺注射液中除了常见的二肽降解杂质，还有如L-丙氨酰-L-谷氨酸-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酸-（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）等四肽降解杂质[4]，结构式如图1所示。然而，关于本品杂质定量研究的文献报道主要集中于二肽降解杂质，并未见对四肽降解杂质的定量研究。

本文采用高效液相色谱法对上述两种四肽降解杂质进行分离测定，操作简便，专属性强。

图1四肽降解杂质结构式

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Waters2489高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Delta320酸度计（梅特勒托利多公司）。

丙氨酰谷氨酰胺注射液自制样品（批号：20170504、20170505、20170506），安徽丰原药业股份有限公司；丙氨酰谷氨酰胺注射液参比制剂（批号：80KL082），华瑞制药有限公司；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Ala-Gln）、环-（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）[cyclo(Ala-Gln)]、环-（L-丙氨酰-L-谷氨酸）[cyclo(Ala-Glu)]、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸（pyroGlu-Ala）、L-焦谷氨酸（pyroGlu）、D-丙氨酰-L-谷氨酰胺（D-Ala-Gln）、L-丙氨酰-L-谷氨酸（Ala-Glu）对照品，BACHEM公司；L-丙氨酰-L-谷氨酸-（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）[Ala-Glu-(Ala-Gln)]、L-丙氨酰-L-谷氨酸-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Ala-Glu-Ala-Gln）对照品，深圳博泰尔生物技术有限公司；乙腈为色谱纯（DIKMA）；甲酸、氨水为分析纯，国药集团；水为纯净水，屈臣氏。

2 方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 色谱条件

色谱柱为氨基键合硅胶柱（Thermo Fisher Hypersil APS-2NH2，4.6mm×250mm，5μm），检测波长为215 nm，流速为0.8mL/min，柱温为35℃，进样量为20μL，流动相为0.1mol/L甲酸溶液（用氨水调pH至3.5）-乙腈（32∶68）。

2.1.2 溶液配制

对照品储备液：精密称取四肽杂质Ala-Glu-(Ala-Gln)、Ala-Glu-Ala-Gln对照品适量，分别加流动相溶解并稀释制成浓度约为0.5mg/mL的溶液。

杂质对照品溶液：精密量取各对照品储备液适量，分别加流动相溶解并稀释成浓度约为20μg/mL的溶液。

供试品溶液：精密量取本品1mL，置50mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.2 系统适用性试验

分别精密称取主成分和各杂质对照品适量，加流动相溶解并稀释制成各成分浓度约为20μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。取此溶液注入液相色谱仪，计算各相邻杂质之间、主成分与相邻杂质之间的分离度。结果表明，空白溶剂无干扰，各组份分离良好。系统适用性色谱图见图2。

图2系统适用性色谱图

2.3 定量限和检测限

取对照品储备液逐级稀释，并分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按信噪比10∶1计算，两种四肽杂质的定量限均约为20ng；按信噪比3∶1计算，两种四肽杂质的定量限均约为5ng，说明本方法满足检测要求。

2.4 线性和范围

取对照品储备液，分别加流动相逐级稀释制成浓度为1μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。结果表明，两种四肽杂质在相应浓度范围内线性关系良好。考查结果见表1。

表1线性关系考查结果（n=6）

2.5 准确度

精密量取本品1mL，置50mL量瓶中，分别加入对照品储备液1mL、2mL、3mL，制成低、中、高浓度混合溶液各3份，加流动相稀释至刻度。精密量取上述各溶液及杂质对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算两种四肽杂质的回收率。结果显示，杂质Ala-Glu-(Ala-Gln)、Ala-Glu-Ala-Gln的平均回收率分别为101.13%、100.96%，说明本方法准确度较高。

2.6 重复性

按“2.1.2”平行配制供试品溶液6份，精密量取上述各溶液及杂质对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算各四肽杂质含量和RSD（n=6）。结果表明，杂质Ala-Glu-(Ala-Gln)、Ala-Glu-Ala-Gln重复性测定RSD分别为0.78%、1.02%，重复性良好。

2.7 溶液稳定性

取供试品溶液，室温放置，并分别于0h、4h、8h、12 h、16h和20h取样测定。结果表明，主成分和各杂质峰面积RSD均小于2.0%，且无新增杂质出现，供试品溶液在20h内稳定性良好。

2.8 样品测定

精密量取三批自制样品和参比制剂各1mL，分别置于50mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为样品溶液。分别取各样品溶液、杂质对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算各四肽杂质含量。结果显示，自制样品与参比制剂两种四肽杂质含量相当，测定结果见表2。

表2自制样品与参比制剂测定结果

3 结论与讨论

3.1 流动相选择

方法筛选过程中，首先参考了中国药典丙氨酰谷氨酰胺注射液有关物质测定方法[5]，使用0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调pH至4.0）-乙腈（35∶65）作为流动相，结果显示，此方法能够较好地分离主成分、二肽类杂质，但四肽类杂质无法完全分离且有拖尾现象。后来又根据吴强、刘伟、何广卫的研究[6]，使用0.0005mol/L硫酸溶液作为流动相，试验表明此方法根本无法检出四肽类杂质。最后，在中国药典的基础上，将流动相调整为0.1mol/L甲酸溶液（用氨水调pH至3.5）-乙腈（32∶68），并对柱温、流速进行了微调，结果显示，此方法能够同时有效分离主成分和各类降解杂质，峰型完美。验证结果表明该方法准确可靠。

3.2 杂质谱分析

丙氨酰谷氨酰胺是由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺缩合形成的二肽类药物，对高温、高湿均非常敏感，制成注射液后，高温灭菌和长期储存更易导致降解杂质产生[7]。通过本研究，对丙氨酰谷氨酰胺注射液杂质谱进行了溯源分析，主要降解杂质有：①氨基酸单体：如L-丙氨酸、L-谷氨酰胺等，由水解产生；②二肽类杂质：如cyclo(Ala-Gln)、cyclo(Ala-Glu)、pyroGlu-Ala等，由脱水环合产生；如D-Ala-Gln等，由高温下构型翻转产生；③四肽类杂质：如Ala-Glu-(Ala-Gln)、Ala-Glu-Ala-Gln等，由两分子二肽酰胺化反应产生。