可变剪切事件在胰腺癌中的发生及其临床意义

帕成周，张贯启，邬善敏

可变剪切(alternative splicing，AS)又称选择性剪切，在mRAN前体到成熟mRNA的这一过程中，不同的剪切方式使得同一个基因可以产生多个不同的成熟mRNA，最终产生不同的蛋白质[1]。AS包含7种选择性剪切类型，即可变受体位点(AA)、可变供体位点(AD)、可变启动子(AP)、可变终止子(AT)、外显子跳跃(ES)、外显子互斥(ME)、内含子保留(RI)。

胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)常见的首发症状为上腹部疼痛及不适，早期缺乏特异的临床表现，容易忽略，就诊率低。据中国国家癌症中心统计数据显示[2]，2015年我国PAAD发病率位居恶性肿瘤第9位，死亡率位居恶性肿瘤第6位。PAAD现有治疗手段有限，目前尚未明确发现PAAD的发生发展机制及其相应靶基因的作用。近年来研究表明[3-4]，AS事件常在癌症中发生，可用于肿瘤靶向治疗，且被认为与肿瘤发生发展密切相关。现分析AS事件在PAAD中的发生情况、临床生存率及调控网络，以便为临床评估及深入研究提供依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 数据集下载及筛选 自癌症基因组图谱(TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov/projects)下载并整理TCGA胰腺癌队列的RNA-seq数据、临床数据，获取PAAD病例的临床病理参数和预后资料，并提取剪接因子(splicing factor，SF)表达量。采用TCGA SpliceSeq工具(https://bioinformatics.mdanderson.org/TCGASpliceSeq/)进行拼接百分比值(percent-splice-in值，PSI值)数据下载及提取可变剪切事件数据，探索与PAAD相关的AS事件的变化。

1.2 生物信息学及统计学分析 利用UpSetR包定量分析PAAD中7种AS类型之间的交集；对172例总生存期至少90 d的PAAD患者，采用单因素Cox分析筛选出与生存显著相关的AS事件数据，定量分析PAAD中7种与生存相关的AS类型之间的交集，进行与生存相关AS事件的亚组分析。利用Lasson回归筛选后构建Cox模型,借助AS事件的PSI值及回归系数计算PAAD患者风险值并截取中位值，分为高、低风险2组。使用Survival包对纳入的80例具有完整临床资料的PAAD患者，采用Kaplan-Meier法进行生存分析，采用单因素Cox回归分析选择可能影响PAAD预后的因素，采用多因素Cox回归分析验证风险值与PAAD患者生存时间的相关性。采用Cytoscape(3.7.1版)构建PAAD生存相关AS事件与SF的调控网络。本研究所有资料均用R(3.5.2版)进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PAAD中AS事件发生数目及与生存相关的AS事件发生数目 在PAAD样品中，发现1 805个基因只发生ES，1 125个基因只发生AT，757个基因只发生AP，最常见的AS事件前3位分别是ES、AT、AP，ME为最罕见的AS事件，见图1A。经单因素Cox分析选取与生存相关的AS事件，研究表明与生存相关发生AS事件前3位为ES、AP、AT，ME仍较少见。其中，938个基因只发生ES，597个基因只发生AP，592个基因只发生AT，见图1B。

2.2 PAAD中与生存相关的各型AS事件分析 在单因素Cox分析选取的数据基础上进行各类型AS事件的可视化分析，分别显示了7种类型中与生存相关最重要的20个AS事件，CD44基因中发生的ES事件与生存显著相关，UBA1、VRK3、SPAG7、ITGB1BP1、SPINT2、DNM2基因中分别对应发生的AP、AT、RI、AA、AD、ME事件与生存显著相关，并且大多数AP、RI事件是PAAD的危险因素，见图2。

2.3 PAAD中AS事件的临床生存分析 通过构建Cox模型，见表1，利用PSI值、回归系数计算PAAD患者风险值中位值为1.00，并将所有AS事件分为高、低风险2组，比较2组生存差异。通过Kaplan-Meier分析可发现高、低风险2组的生存差异具有统计学意义(χ2=42.10,P<0.01)。高风险组的中位生存期为1.3年，低风险组则为5.6年。值得注意的是，随访至第6年时，高风险组无存活患者，低风险组仍有2例存活，见图3A。ROC曲线的AUC为0.765，表明该模型构建比较准确，见图3B。单因素Cox回归分析表明风险值与患者总体生存率密切相关；多因素Cox回归分析则进一步提示高风险值是影响PAAD患者预后的独立危险因素(HR 1.050，95%CI1.03～1.07，P=0.000)，见表2。

2.4 PAAD中生存相关AS事件与SF的调控网络 为了探索生存相关AS事件之间的功能关系(|cor|>0.8，P<0.01)，使用Cytoscape生成基因相互作用网络显示，CELF3、CELF4、MSI1、NOVA1、CIRBP等剪接因子在调控网络与AS事件密切相关。ELAVL3对高风险的AS事件起负调控作用，PRPF39对低风险的AS事件起正调控作用，而CPSF6对低风险的AS事件起负调控作用。同时可以发现，RALYL存在对高风险AS事件负调控及低风险AS事件正调控的双重作用，见图4。

表1 基于AS事件的Cox模型参数

表2 单因素Cox回归分析PAAD临床特征、AS事件风险值和总体生存率的相关性

3 讨 论

剪切因子(SF)是参与RNA前体剪切过程的蛋白质因子，表达异常会导致基因的AS发生改变，增加了基因组表达mRNA的多样性，使其编码的蛋白质改变，进而改变表型。在肿瘤中，SF表达异常可能会引起特定促癌剪切异构体的形成，从而导致癌症的发生[3]。本研究中，基于AS事件的风险值计算，发现风险值可作为预后特征。SF和生存相关AS事件之间存在调控关系的研究，让人们对PAAD中SF在AS事件所处的调控中心有了更深入的认识。

在PAAD中与生存相关的AS事件发生情况的研究发现，位列首位为ES。同样，有研究发现在乳腺癌、前列腺癌中ES也是主要的AS事件[5-6]，可能与RNA的保守性及存在顺式调控元件相关，目前尚未完全阐明。在亚组AS事件可视化分析中得到的部分基因在PAAD中的作用得到了实验验证。研究证实ESRP可以调节CD44 v8-10和v6-10外显子的剪接[7]，且CD44的选择性剪接调控因子在正常或肿瘤细胞中的下调并不影响CD44的总mRNA水平[8]。在细胞水平及临床研究中发现[9-10]，CD44阳性表达的胰腺癌细胞较CD44阴性亚群相比恶性程度更高，且与T分期、TNM分期、淋巴结转移、分化程度和肿瘤部位等相关。在肿瘤形成方面，CD44高表达的肿瘤组织在大小和质量上更占优势。肿瘤中的UBA1、VRK3、SPAG7、ITGB1BP1、SPINT2、DNM2等基因中的AS事件值得关注。

通过ROC曲线，分析了AS事件对PAAD预后的预测能力。结果表明，AS事件与PAAD患者的存活时间相关，高风险值可作为PAAD的不良预后因素。此外，本研究分析也强调了SF在AS事件中潜在的调节网络。有研究发现[11]，通过删除MSI1/MSI2使得胰腺上皮内瘤变进展为腺癌的速度减慢，MSI1的缺失可引起小鼠MR下的肿瘤体积减少为原来的1/5倍。同样，有实验研究证实NOVA1与胰腺β细胞功能有关，如胞吐作用、转录、胰岛素受体信号传导、剪接和细胞凋亡[12]。但是，调控网络中凸显出的SF功能及作用机制还需要深入探索。调控网络还显示出明显的趋势，即大多数低风险AS事件与SF的表达呈正相关，而高风险AS事件与SF的表达呈负相关。尽管如此，一些特定SF表达的下调是否会导致低风险AS事件减少和高风险AS事件增加还需要进一步通过实验验证。

当前癌症治疗的主要难题是患者对治疗药物产生了耐药性，导致治疗失败。一项研究表明[13]，剪接体突变改变了剪接位点和/或外显子的识别偏好，这种机制的变化可能会在癌细胞中产生突破点，利用剪接体突变的生化特性、基因组和生物学效应优化肿瘤治疗方法和手段。Siegfried等[14]研究发现胰腺导管腺癌细胞中丙酮酸激酶基因(PKM)的AS受到影响，导致促进与癌症相关的PKM2亚型表达升高，可增强胰腺肿瘤对吉西他滨的耐药性。此外，通过反义寡核苷酸切换PKM剪接，从而有利于PKM1的替代变体表达，增强氧化磷酸化，使胰腺肿瘤细胞对吉西他滨消除耐药性，进而成为改善胰腺导管腺癌对化疗反应的新潜在治疗靶点。

总之，本研究对PAAD中与生存相关的AS事件进行了概述，并建立了有价值的预后模型，可用于疾病预后预测。AS事件与SF之间的调控网络提出了SF如何潜在调节PAAD中AS事件的新见解。这些与生存相关的AS事件和SF为PAAD患者提供了许多新的治疗靶点，值得进一步深入研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

帕成周:查阅网络生物信息数据挖掘资源，完成大部分数据分析，论文撰写；张贯启:完成部分数据分析，论文指导；邬善敏:论文审核