n-3多不饱和脂肪酸对大鼠酒精性脂肪肝炎性反应及肝纤维化的影响

沈云海，付明生，刘秀平，冯洁，潘勤聪

酒精性脂肪肝是由长期大量饮酒引起的肝脏疾病，其组织学特征为肝脏内脂质沉积，可逐步发展为酒精性肝炎、肝硬化，表现为肝脏内炎性反应过度激活及纤维化的加剧[1]。在临床实践中，治疗酒精性脂肪肝的关键在于减轻炎性反应的激活、延缓肝纤维化的进程并最大限度地预防肝硬化的发生[2]。近年来关于肝炎及肝纤维化的研究认为，Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)通路在炎性反应及组织纤维化中起到关键调控作用，该通路激活后NF-κB向细胞核内移位并调控TNF-α、MCP-1和IL-1等多种细胞因子的表达[3-4]，炎性细胞因子的表达能够激活炎性反应，进而通过肝星状细胞活化、TGF-β1的大量分泌来引起细胞外基质异常的合成和降解，进而逐步形成组织纤维化[5-6]。n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)及n-6 PUFA是体内参与花生四烯酸代谢的前体物质，研究认为[7]，n-3PUFA代谢过程的副产物具有抗炎活性，而n-6 PUFA代谢过程中的产物具有促炎活性，适当使用n-3 PUFA能在多种疾病的病理进程中起到改善作用。喻日成等[8]关于非酒精性脂肪肝的动物实验研究证实，n-3PUFA能够改善非酒精性脂肪肝模型大鼠的脂代谢及炎性反应，但n-3PUFA在酒精性脂肪肝中的应用价值尚不明确。为此，本研究通过分析n-3PUFA对大鼠酒精性脂肪肝炎性反应、肝纤维化的影响及具体机制，旨在为临床酒精性脂肪肝的治疗提供新思路，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量160～200 g，购自上海斯莱克实验动物公司，许可证SCXK(沪)2014-0007；n-3PUFA、TLR4激动剂内毒素(LPS)购自Sigma公司，酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自上海西唐公司，超纯RNA提取试剂盒、SuperRTcDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture试剂盒购自北京康为世纪公司。荧光定量PCR仪购自Bio-rad公司，酶标仪购自Bio-tek公司，高速冷冻离心机购自Hettich公司。

1.2 动物分组及实验方法 40只SD大鼠编号后按照随机数表法分为对照组、模型组、n-3PUFA组、n-3PUFA+LPS组，每组各10只。模型组、n-3PUFA组、n-3PUFA+LPS组3组大鼠参照文献[9]的研究建立酒精性脂肪肝模型，具体如下：给予40%酒精15 ml·kg-1·d-1灌胃，连续8周；n-3PUFA组在酒精灌胃过程中给予n-3PUFA干预，即在饲料中加入剂量为1.0 g/d的n-3PUFA；n-3PUFA+LPS组在酒精灌胃过程中给予n-3PUFA及LPS干预，n-3PUFA干预方式同n-3PUFA组，同时给予1.0 g/d LPS尾静脉注射。对照组给予正常饲料及每日生理盐水灌胃。动物实验第8周后处死各组大鼠进行相关指标检测。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 肝脏中炎性因子基因表达的检测：第8周后，处死各组大鼠并剖检各动物肝脏，采用超纯RNA提取试剂盒分离肝脏中的RNA，采用SuperRTcDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录为cDNA，采用UltraSYBR Mixture试剂盒对cDNA中的TLR4、NF-κB、TNF-α、MCP-1和IL-1进行扩增反应，反应体系如下，cDNA反应混合液10 μl、上下游引物各0.4 μl、去离子水8.2 μl，按照95℃ 15 s、60℃ 30 s的程序反应40个循环，仪器自动生成反应循环曲线及循环阈值(Ct)，按照2-ΔΔCt公式计算mRNA表达水平。

1.3.2 血清肝纤维化指标的检测：第8周后，处死大鼠并收集外周血10 ml，3 000 r/min离心10 min，分离血清后采用ELISA试剂盒测定转化生长因子-β1(TGF-β1)、透明质酸(HA)和Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)水平，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 4组大鼠干预后的组织学变化 对照组大鼠光镜下肝细胞大小、形态正常，细胞边界清晰，肝窦无扩张；模型组大鼠光镜下可见弥漫性分布的肝细胞脂肪变性，n-3PUFA组大鼠光镜下可见肝细胞脂肪变性、但较模型组大鼠减轻；n-3PUFA+LPS组大鼠光镜下可见肝细胞脂肪变性，但较n-3PUFA组大鼠加重，见图1。

2.2 4组大鼠肝脏中TLR4和NF-κB基因表达水平比较 模型组大鼠肝脏中TLR4和NF-κB的mRNA表达水平明显高于对照组，n-3PUFA组大鼠肝脏中TLR4和NF-κB的mRNA表达水平明显低于模型组，n-3PUFA+LPS组大鼠肝脏中TLR4和NF-κB的mRNA表达水平明显高于n-3PUFA组，组间差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠肝脏组织TLR4、NF-κB mRNA表达水平的比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与n-3PUFA组比较，cP<0.05

2.3 4组大鼠肝脏中炎性细胞因子基因表达水平比较 模型组大鼠肝脏中TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表达水平明显高于对照组，n-3PUFA组大鼠肝脏中TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表达水平明显低于模型组，n-3PUFA+LPS组大鼠肝脏中TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表达水平明显高于n-3PUFA组，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4 4组大鼠血清中肝纤维化指标比较 模型组大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明显高于对照组，n-3PUFA组大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明显低于模型组，n-3PUFA+LPS组大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明显高于n-3PUFA组，各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 各组大鼠肝脏组织TNF-α、MCP-1、IL-1 mRNA表达水平比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与n-3PUFA组比较，cP<0.05

表3 各组大鼠血清肝纤维化指标比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与n-3PUFA组比较，cP<0.05

3 讨 论

酒精性脂肪肝是长期大量饮酒引起的肝脏疾病，可逐步向酒精性肝炎、酒精性肝硬化发展，脂肪在肝脏中沉积后引起炎性反应及肝纤维化激活是造成酒精性肝炎及肝硬化发生的关键病理环节[10-11]。本研究结果显示，模型组大鼠肝脏中TLR4、NF-κB、TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表达水平均明显升高。以上结果说明模型大鼠的肝脏病变特点与酒精性脂肪肝的临床病理学特征相吻合，肝脏内脂质沉积且TLR4/NF-κB通路介导的炎性反应明显激活，模型建立成功。

治疗酒精性脂肪肝的关键是抑制肝脏内持续激活的炎性反应，n-3PUFA是一类具有抗炎活性的不饱和脂肪酸，参与花生四烯酸代谢的过程并减少具有促炎作用的前列腺素分泌，同时也能调节脂质代谢[12-14]。n-3PUFA用于非酒精性脂肪肝的相关研究发现，非酒精性脂肪肝大鼠接受n-3PUFA干预后的炎性反应和肝纤维化均得到改善。本研究结果显示，n-3PUFA组大鼠肝脏中脂肪变性明显减轻，TLR4、NF-κB、TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表达水平均明显低于模型组，表明n-3PUFA能够抑制酒精性脂肪肝大鼠肝脏内TLR4/NF-κB通路分子及下游细胞因子的表达，用于酒精性脂肪肝的治疗能够起到抑制炎性反应激活的作用。

对照组 模型组 n-PUFA-3组 nPUFA-3+LPS组

图1干预后4组肝脏的病理变化 (HE染色，×200)

TLR4/NF-κB通路下游细胞因子TNF-α、MCP-1和IL-1直接参与炎性反应的调控。TLR4将细胞外信号向细胞内传递后，NF-κB与相应的抑制分子I-κB解离，游离的NF-κB移位进入细胞核并启动TNF-α、MCP-1和IL-1的表达[15-16]。TNF-α和IL-1具有促炎活性，能够使多种炎性细胞发生活化并向肝脏组织浸润[17-18]；MCP-1对单核细胞具有趋化活性，能够促进单核细胞向肝脏组织趋化运动[19-20]。为了明确n-3 PUFA是否直接通过TLR4/NF-κB通路来抑制肝脏组织中TNF-α、MCP-1和IL-1的表达，本研究在n-3 PUFA干预的同时联合使用了TLR4激动剂LPS，结果显示，n-3PUFA+LPS组大鼠肝脏中TNF-α、MCP-1和IL-1的mRNA表达水平均明显高于n-3PUFA组，表明n-3PUFA抑制TNF-α、MCP-1和IL-1表达的作用被TLR4激动剂LPS所逆转，进而提示，n-3PUFA通过抑制TLR4/NF-κB通路来抑制酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织中TNF-α、MCP-1和IL-1的表达。

HA和C-Ⅳ是肝脏基质中的主要成分，在肝纤维化的过程中2种成分大量合成，同时造成血清中HA及C-Ⅳ的释放增多。本研究结果显示，模型组大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明显高于对照组，提示酒精性脂肪肝大鼠体内存在不同程度的肝纤维化。在使用n-3PUFA干预后发现，n-3PUFA组大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明显低于模型组；n-3PUFA+LPS组大鼠的血清TGF-β1、HA和C-Ⅳ含量均明显高于n-3PUFA组。表明n-3PUFA能够抑制酒精性脂肪肝大鼠体内的肝纤维化过程，且这一抑制作用能够被TLR4激动剂LPS所逆转。提示n-3PUFA可通过抑制TLR4/NF-κB通路来抑制酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织中的纤维化过程。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

沈云海：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写;付明生、刘秀平：动物实验，包括造模、给药、取材;刘秀平、冯洁：分子生物学实验，包括PCR及ELISA检测;潘勤聪：课题设计，论文撰写