丹参酮ⅡA 对氧化型低密度脂蛋白诱导血管内皮损伤的防护作用*

唐 林，黎宗宝，白瑞娜

（1. 海南省人民医院中医科，海南 海口 570311； 2. 海南省人民医院急救中心，海南 海口 570311；3. 中国中医科学院西苑医院心血管内科，北京 100091）

血管内皮细胞结构及功能改变与心血管疾病的发生密切相关[1]。董霄等[2]研究发现，脂质中氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）代谢异常是诱导血管内皮细胞功能紊乱和平滑肌细胞增生的重要危险因素。体内OX-LDL过量时可导致胆固醇沉积于动脉血管壁，增加动脉硬化发生风险[3]。李婷等[4]研究发现，OX-LDL 可通过抑制Akt/mTOR/p70S6K 信号通路诱导人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）自噬。细胞自噬是在自噬相关基因调控下利用溶酶体降解受损细胞器及大分子物质的过程[5]。丹参酮ⅡA为丹参提取物，具有扩张血管、降血压、抗血栓的功效，对大鼠心肌缺血再灌注损伤诱导的氧化应激反应抑制作用显著[6]。本研究中探讨了丹参酮ⅡA对OXLDL 诱导的血管内皮损伤的保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

HUVEC 细胞（上海纪宁生物科技有限公司，批号为JN-B1888）；DMEM 培养基（美国Gibco 公司，货号为11966025）；10% 胎牛血清（美国Gibco 公司，货号为10099-141）；0.25%胰酶细胞消化液（上海碧云天生物技术有限公司，批号为C0201）；乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（北京百奥莱博科技有限公司，批号为YT412）；OX -LDL（美国Solarbio 公司，批号为H7950，规格为2 mg）；丹参酮ⅡA（上海纯优生物科技有限公司，批号为P0019）；硫代巴比妥酸（常州市海拓实验仪器有限公司，批号为20170209）；rad680 型酶标仪（美国Bio 公司）；黄嘌呤氧化酶（大连美仑生物技术有限公司，批号为MB3079）；单丹磺酰戊二胺（MDC，上海懋康生物科技有限公司，批号为MX-4453）；山羊血清（美国Solarbio 公司，批号为SL038）；兔抗MAP1LC3[2]B 抗体（艾美捷科技有限公司，批号为R-155-100）；HRP 标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京碧云天生物科技有限公司，批号为A0216）；DAPI 染色液（北京雷根生物技术有限公司，批号为DA0001）。

1.2 方法

细胞培养及处理：将HUVEC 接种于含DMEM 培养基、10%胎牛血清的培养液中培养，条件为37 ℃及5%CO2，每2 d 换液1 次，并进行传代，直至细胞生长至对数期。取出细胞加入0.25%胰酶细胞消化液和EDTA溶液消化细胞。

丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力测定：将细胞分为空白对照组（A 组）、OX-LDL 处理组[25 mg/L（B1组）、50 mg/L（B2组）、75 mg/L（B3组）、100 mg/L（B4组）]、B4组+丹参酮ⅡA处理组[0 mg/L（C1组）、0.5 mg/L（C2组）、1.0 mg/L（C3组）、1.5 mg/L（C4组）]，分别处理24h 后测定细胞中MDA 和SOD 含量。

将50 μL 硫代巴比妥酸加入各组细胞中，充分混匀后95 ℃下水浴40 min，冷却后离心10 min（转速为1 000 r/min），取上清液在532 nm 波长处利用酶标仪测定吸光度，计算MDA 相对含量。将20 μL 黄嘌呤氧化酶加入各组细胞中，充分混匀后37 ℃下孵育20 min，测定其在450 nm 波长处的吸光度，计算SOD 活力。

细胞自噬：取A 组和各组细胞比较阳性细胞比例。细胞置离心仪离心5 min（转速为1 000 r/min），加入磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，弃去上清液，再加入PBS 溶液重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106个/mL；取适量细胞悬液置新EP 管中，加入50 μmol/L 单丹磺酰戊二胺，室温避光染色30 min；PBS 清洗3 次，每次5 min，荧光显微镜下观察其在355 nm 处的细胞计数。

自噬小体表达：取B4组细胞，分别用0，0.5，1.0，1.5 mg/L 丹参酮ⅡA处理，比较各组细胞阳性细胞比例，并观察细胞自噬现象。每组细胞取3 份接种于24 孔板内，每孔细胞计数107，室温孵育24 h；滴加封闭山羊血清，室温封闭20 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；以1 ∶200 的比例加入兔抗MAP1LC3[3]B 抗体，4 ℃下过夜，PBS 清洗3 次，每次5 min；以1 ∶500 的比例加入HRP 标记山羊抗小鼠IgG（H+L），室温静置1 h，PBS 溶液清洗3 次，每次5 min；加DAPI 染色液染色5 min，显微镜下观察染色情况，PBS 清洗3 次，每次5 min；甘油封片后利用荧光倒置显微镜观察自噬小体。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0 统计学软件分析。计量资料以表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析。计数资料以率（%）表示，行χ2检验。危险因素采用Logistic 回归分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDA 含量及SOD 活力

与A 组比较，B 组MDA 含量明显升高（F=493.724，P ＜0.05），SOD 活力明显降低（F=9.770，P ＜0.05）；随着OX-LDL 剂量增加，B 组MDA 含量逐渐升高（F=151.508，P ＜0.05），SOD 活力逐渐下降（F=6.035，P ＜0.05）；与B4组比较，随着丹参酮ⅡA剂量增加，MDA 含量逐渐减少（F=374.014，P ＜0.05），SOD 活力逐渐增加（F=5.621，P ＜0.05）。详见表1。

表1 各组MDA 含量及SOD 活力比较（±s，n=3）

表1 各组MDA 含量及SOD 活力比较（±s，n=3）

注：与A 组比较，*P ＜0.05；与B4 组比较，#P ＜0.05。

组别A 组B1 组B2 组B3 组B4 组MDA 含量（nmol/mL）1.68±0.12 4.57±0.15*5.74±0.18*6.52±0.21*7.87±0.23*SOD 活力（mU/mL）101.14±13.45 84.24±10.26*72.12±9.64*63.45±9.57*51.54±9.46*组别C1 组C2 组C3 组C4 组MDA 含量（nmol/mL）6.68±0.24#5.13±0.21#3.12±0.24#1.87±0.18#SOD 活力（mU/mL）68.97±12.87#76.57±13.54#86.45±13.73#97.42±13.57#

2.2 OX-LDL 对细胞自噬水平的影响

与A 组比较，随着OX-LDL 剂量增加，细胞自噬水平逐渐上升（P ＜0.05）；不同OX-LDL 剂量阳性细胞比例分别为19.3%，27.1%，34.6%，45.3%，与A 组（5.2%）比较，阳性细胞比例明显增加（P＜0.05）。详见图1。

2.3 丹参酮ⅡA 对OX-LDL 处理细胞自噬水平的影响

随着丹参酮ⅡA剂量增加，细胞自噬水平逐渐下降（P ＜0.05）；不同丹参酮ⅡA剂量处理阳性细胞比例分别为43.5%，30.6%，23.6%，17.6%，与B4组（45.3%）比较，阳性细胞比例明显降低（P ＜0.05）。详见图2。

2.4 细胞自噬现象

通过OX-LDL 处理后，细胞形成LC3 自噬小体，细胞自噬水平上升；丹参酮ⅡA干预后，细胞中LC3 自噬小体减少，细胞自噬水平下降。详见图3。

图1 不同剂量OX-LDL 对细胞自噬水平的影响

图2 不同剂量丹参酮ⅡA 对OX-LDL 处理细胞自噬水平的影响

图3 各组细胞自噬现象

3 讨论

动脉粥样硬化（AS）的发病基础与脂质代谢紊乱密切相关，其中OX-LDL 为导致血管内皮损伤的主要原因[7]。祖国医学认为，AS 与气虚、血瘀、痰浊有关[8]，故中医治疗常以活血化瘀为主[9]。丹参为常用中药材，具有活血调经、祛瘀止痛的功效。丹参酮ⅡA为丹参提取物之一。陈少秀等[10]研究发现，丹参酮ⅡA可提高肾移植术后大鼠体内SOD 活性，抑制MDA 产生，抑制其肾小管上皮细胞凋亡，达到肾缺血再灌注损伤防护作用。

正常情况下，体内氧自由基反应与脂质过氧化反应的稳态是维持体内新陈代谢的重要机制，动态平衡失调可引起新陈代谢失常及免疫功能下降，破坏生物膜及其功能，发生脂质过氧化。脂质过氧化可产生大量脂质过氧化产物MDA，改变细胞膜流动性及通透性，最终导致细胞结构改变。SOD 是体内的活性物质，能清除新陈代谢产生的有害物质。体内LDL 经氧化修饰后可形成OX-LDL，OX-LDL 通过引发自由基链式反应可产生多种反应性醛。本研究中通过OX-LDL 处理HUVEC细胞发现，随着OX-LDL 剂量的增加，细胞MDA 含量逐渐升高，SOD 活力逐渐下降，表明OX-LDL 对血管内皮有损伤作用，并能使血管内皮细胞发生氧化应激反应。叶张章等[11]研究发现，原发性高血压患者AS 的发生、发展与患者血清中胆红素水平及氧化应激反应密切相关。郝阳等[12]研究发现，氧化应激可促进细胞自噬水平的升高，自噬水平上升可导致细胞程序性死亡而引发疾病。当细胞出现自噬现象时，附着于粗面内质网无核糖体的双层膜包裹的胞质与细胞中降解的细胞器及蛋白质成分可形成自噬体[13]。自噬体是细胞程序性死亡中分解老化及损伤细胞的主体。本研究中通过OXLDL 处理HUVEC 细胞发现，随着OX-LDL 剂量的增加，细胞自噬水平逐渐上升，阳性细胞比例逐渐增加，表明OX-LDL 可通过影响体内氧化应激反应，激活细胞自噬，产生自噬小体。本研究中选择以100 mg/L OXLDL 处理过的细胞，通过不同质量浓度丹参酮ⅡA作用后发现，随着丹参酮ⅡA剂量的增加，细胞中LC3 自噬小体减少，细胞自噬水平逐渐下降，阳性细胞比例逐渐降低，表明丹参酮ⅡA对细胞自噬水平有抑制作用，可减轻细胞氧化应激损伤，对细胞有保护作用。

综上所述，体内OX-LDL 含量的增加对血管内皮具有损伤作用，丹参酮ⅡA可通过降低体内MDA 含量，增加SOD 活力，从而提高HUVEC 细胞抗氧化应激损伤能力，并降低细胞自噬水平，具有保护血管的作用。但本研究还缺乏对丹参酮ⅡA血管保护作用机制的研究，有待进一步深入探讨。