斑蝥素对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的影响

邱立强，李雯静，夏豪，江洪，徐昌武

随着我国经济的发展和人群生活方式的改变，心血管疾病发病率逐年升高，心血管疾病死亡为城乡居民死亡首因[1]。当前，介入治疗手段已成为治疗心血管疾病的重要方法[2-3]，然而术后新生内膜过度增生和靶血管再狭窄的发生往往导致手术失败[4-5]。研究表明，术后局部炎症反应在血管内再狭窄的发生和发展中颇为关键[6-7]。斑蝥素是传统中药斑蝥的主要活性成分，本课题组在前期研究[8]中发现，斑蝥素可显著抑制大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和迁移，且作用机制可能与包括核转录因子（NF-κB）在内的多种信号通路有关。本实验拟在这一现象的基础上，通过细胞培养进一步探讨斑蝥素抑制血管平滑肌细胞迁移与NF-κB信号通路介导的炎症反应的关系，并在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中进一步验证斑蝥素对损伤血管内膜增生的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

250～300 g SD 健康雄性大鼠购自湖北省实验动物研究中心；斑蝥素、二甲基亚砜（DMSO）和脂多糖（LPS）购自美国Sigma 公司，吡咯烷二硫代氨甲基甲酸盐（PDTC）购自北京索莱宝生物公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）检测试剂盒（ELISA 试剂盒）购自美国ImmunoWay 生物公司。Fogarty 球囊导管购自美国Edwards Lifescience公司；莱卡荧光倒置显微镜及拍照系统购自德国Lecia 公司；杜氏改良Eagle 培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）、1×磷酸盐缓冲液（PBS，137 mmol/L 氯化钠，2.7 nmol/L 氯化钾和10 mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH：7.3～7.5）购自美国HyClone 公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司；双抗购自杭州吉诺公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自碧云天生物技术研究所；NF-κB p65（p65）、磷酸化NF-κB p65（p-p65）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、TNF-α 和IL-6 抗体均购自美国CST 公司；辣根过氧化物酶标记二抗、ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜购自美国merck-millipore。

1.2 斑蝥素对VSMC 迁移的影响

VSMC 的分离培养与鉴定：关于大鼠胸主动脉VSMC 分离培养和细胞鉴定等具体实验方法可见本课题组前期研究成果[8]，本文不再赘述。

实验分组：（1）对照组；（2）1 μg/ml LPS 刺激组（LPS 组）；（3）LPS 刺激后加用5 μmol/L 斑蝥素组（斑蝥素组）；（4）LPS 刺激后加用80 μmol/L PDTC 处理组（PDTC 组）；（5）LPS 刺激后加用5 μmol/L 斑蝥素和80 μmol/L PDTC 处理组（斑蝥素+PDTC 组）；共5 组。

伤口愈合实验：如文献[9]所述，将细胞按1.0×105个/孔种植于6 孔板内。待细胞完全覆盖6 孔板底壁后，用1 ml 枪头在6 孔板内划两条垂直直线，并用PBS 清洗以除去漂浮细胞。然后在含有LPS 的培养液中加入斑蝥素或PDTC 处理。在相同位置分别照取0 h 和36 h 的图像，观察细胞迁移情况。细胞迁移率分析使用Image J 1.51 w 软件进行处理，细胞迁移率=划痕面积（0 h）-划痕面积（36 h）/划痕面积（0 h）。实验重复3 次。

Transwell 实验：如文献[10]中所述，用含或不含相应浓度斑蝥素或PDTC 的培养液将细胞密度调整为5.0×105个/ml，然后每组每孔取200 μl 种植于上室，下室加入600 μl 含15% FBS 的培养基，添加或不添加LPS，于培养箱中孵育12 h 后取出；并将小室用PBS 小心冲洗3 次，用棉签将小室内面未穿过的细胞轻轻擦去，并用4%的多聚甲醛室温固定20 min 后用PBS 小心冲洗3 次；然后将小室放入1 μg/ml 的DAPI 中染色2 min，用PBS 洗涤后在荧光显微镜200 倍下随机选取5 个视野并拍照，最后使用Image J 1.51w 软件（美国NIH）计算穿过小室的细胞数。

蛋白免疫印迹法检测蛋白表达：细胞总蛋白提取后，使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定其蛋白浓度，具体方法见文献[11]，然后加入上样缓冲液煮沸后备用。按每孔30 μg 总蛋白于预先配置好的12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行蛋白分离。然后电转至预先活化好的聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。电转完成后用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h。PBST（1×PBS含0.1%的吐温-20）洗涤3 次×5 min 后，分别与p65、p-p65、MMP-9 及GAPDH 一抗4℃孵育过夜。取出PVDF 膜用PBST 洗涤3 次×5 min，再与辣根过氧化物酶标记的二抗于室温下孵育1 h。然后用PBST 洗涤3 次×5 min。以GAPDH 为内参蛋白，用ECL 显色法于膜上显色后进行扫描，用凝胶图像处理系统Image Lab Software分析目的条带的灰度值。所有实验数据均来自3 次独立实验。

1.3 斑蝥素对颈动脉球囊损伤模型大鼠的影响

动物分组及给药：采用随机数字表法将30 只SD 大鼠随机分为假手术组、损伤组和斑蝥素组，每组10 只。斑蝥素组按2 mg/kg 剂量腹腔注射斑蝥素，假手术组与损伤组大鼠腹腔注射等量生理盐水。造模前1 周开始给药，每天1 次，连续给药3 周。

大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立：依据文献[12]报道方法进行。在手术前禁食12 h，采用2%戊巴比妥钠40 mg/kg 腹腔注射麻醉，在静脉内注射100 U/kg 肝素钠后暴露左侧颈总、颈外和颈内动脉。使用显微血管夹暂时夹闭颈内和颈总动脉，结扎颈外动脉远心端，并在近心端带线，使用眼科剪在颈外动脉距离动脉分叉处约2 mm 处剪一“V”型切口，并将带导引导丝的球囊（球囊直径1.25 mm，长度15 mm）从颈外动脉的切口处向颈总动脉近心端传送，当球囊距离颈总动脉分叉约3 cm 处时退出导丝，使用压力泵向球囊注水充盈球囊贴至血管壁后，维持该压力上下旋转拖曳球囊3 次，然后退出球囊并结扎颈外动脉，松开血管夹恢复颈内动脉血流，最后缝合皮肤。假手术组不插入球囊导管，其余手术操作相同。

颈总动脉内膜检测：将大鼠固定在操作台上，麻醉后暴露左侧损伤颈总动脉并将其剪下后，立即放入生理盐水中冲去管腔中血液，然后放入4%的多聚甲醛中浸泡固定，经石蜡包埋、切片后进行苏木精-伊红（HE）染色，并通过免疫组织化学染色检测MMP-9、p65、TNF-α 和IL-6 的表达。

血清中TNF-α 和IL-6 浓度检测：大鼠麻醉后经下腔静脉取血并以2 100 g 的离心力离心15 min，收集上清液于-80℃冰箱保存，待血液标本收集完全后按ELISA 试剂盒说明书进行ELISA 法检测血清中TNF-α 和IL-6 浓度。

图像分析及免疫组织化学半定量分析：HE 染色和免疫组织化学染色完成后拍取照片，使用Image J 1.51w 软件分别测量各组标本HE 切片中大鼠颈总动脉增生内膜面积和中膜面积，单位用像素（Pixels）表示，并计算出增生内膜面积与中膜面积比值。使用软件内免疫组化图像处理插件测量免疫组织化学目标蛋白的平均吸光度（MD），并应用该数值描述目标蛋白在增生内膜和血管壁中的表达强度。

统计学方法：以 SPSS 22.0 统计软件包进行统计学分析。结果以均数±标准差或率表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 斑蝥素对VSMC 迁移的影响（表1）

伤口愈合实验：与对照组比较，LPS 组细胞迁移率增加61.3%（P＜0.01）；而斑蝥素组、PDTC组及斑蝥素+PDTC 组细胞迁移率较LPS 组均显著减少（P 均＜0.01）；另外，与斑蝥素组比较，斑蝥素+PDTC 组细胞迁移率差异未见统计学意义（P＞0.05）。

Transwell 实验结果：LPS 组细胞穿过小室的数量较对照组显著增多（P＜0.01）；而斑蝥素组、PDTC组及斑蝥素+PDTC 组，穿过小室的细胞数较LPS组均明显减少（P 均＜0.01）；另外，与斑蝥素组比较，斑蝥素+PDTC 组穿过小室的细胞数差异未见统计学意义（P＞0.05）。

表1 斑蝥素对各组血管平滑肌细胞迁移的影响（）

表1 斑蝥素对各组血管平滑肌细胞迁移的影响（）

注：LPS：脂多糖；PDTC：吡咯烷二硫代氨甲基甲酸盐。与对照组相比**P＜0.01；与LPS 组相比ΔΔP＜0.01。伤口愈合实验（n=6）；Transwell实验（n=5）

2.2 斑蝥素对VSMC 内蛋白表达的影响（图1）

与对照组比较，LPS 组VSMC 内MMP-9 和p-p65表达分别增加2.97 倍和1.24 倍（P 均＜0.05）；而与LPS 组比较，斑蝥素组MMP-9 和p-p65 表达分别减少63.4%和46.9%（P 均＜0.05）；PDTC 组MMP-9和p-p65 表达较LPS 组比较，也分别减少37.8%和25.2%（P 均＜0.05）；另外，与斑蝥素组比较，斑蝥素+PDTC 组细胞内MMP-9 和p65 表达差异未见统计学意义（P＞0.05）；而p65 水平在各组间表达差异均未见统计学意义（P＞0.05）。

图1 斑蝥素对VSMC 内蛋白表达的影响（n=3）

2.3 斑蝥素对损伤的大鼠颈动脉内膜的影响（图2）

HE 染色结果显示，损伤组与假手术组比较，血管内膜增生面积[（4.62±0.96）像素 vs（0.33±0.33）像素，P＜0.01]和内膜/中膜面积比值[（68.21±16.11）%vs（9.39±5.80）%，P＜0.01]均显著增加；而斑蝥素组较损伤组血管内膜增生面积减少62.3%[（1.74±0.70）像素vs（4.62±0.96）像素，P＜0.01]，内膜/中膜比值减少48.0%[（35.46±16.07）% vs（68.21±16.11）%，P＜0.01]。

免疫组织化学染色结果显示（表2），与损伤组比较，斑蝥素组血管内膜中p65 表达降低38.4%（P＜0.01），TNF-α 和IL-6 的表达较损伤组分别降低56.3%和53.2%（P＜0.01）；另外，与损伤组比较，斑蝥素组血管内膜中MMP-9 表达降低42.8%（P＜0.05）。

图2 HE 染色检测斑蝥素对损伤的大鼠颈动脉血管内膜增生的影响（×100，n=3）

2.4 斑蝥素对大鼠血清中TNF-α 和IL-6 含量的影响（表2）

ELISA 检测结果显示，与损伤组比较，斑蝥素组大鼠血清内TNF-α 和IL-6 浓度明显降低（P＜0.05）；另外与假手术组比较，损伤组大鼠血清内TNF-α 和IL-6 浓度升高（P＜0.01）。

表2 斑蝥素对大鼠颈动脉内膜和血清中炎性分子表达水平的影响（）

表2 斑蝥素对大鼠颈动脉内膜和血清中炎性分子表达水平的影响（）

注：p65：核转录因子κB p65；TNF-α：肿瘤坏死因子α；IL-6：白细胞介素-6；MMP-9：基质金属蛋白酶-9；MD：平均吸光度。与损伤组比*P＜0.05 **P＜0.01；与假手术组比ΔΔP＜0.01

3 讨论

心血管疾病是全世界因疾病造成死亡的主要原因，严重威胁人类生命健康[13]。心血管疾病经支架置入治疗后引起的内皮损伤导致的炎症反应，是血管内再狭窄发生的重要原因之一。因此，抑制血管炎症反应在治疗血管再狭窄中具有重要意义。斑蝥素是传统中药斑蝥的有效提取成分，是一种选择性蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制剂[14]。PP2A 是细胞内最重要的磷酸酶之一，参与细胞增殖和转录等在内的多种重要的生理过程[15]。研究[8]发现，斑蝥素显著抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移及炎症反应，其机制可能与包括NF-κB 在内的多条信号通路密切相关。

众所周知，NF-κB 信号通路在炎症相关疾病中扮演重要角色。NF-κB 由p50 和p65 两个亚基组成[16]。Landry 等[17]发现，在大鼠颈动脉球囊损伤后p50 和p65 被激活，而其抑制性蛋白IκB-α水平显著降低。事实上，抑制NF-κB 信号通路激活可抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，从而减少血管损伤后新生内膜的形成。本研究发现LPS 可诱导VSMC 内NF-κB p65 的表达，并促进VSMC 迁移；而在LPS 刺激VSMC 的同时加用斑蝥素进行处理后，VSMC 的迁移能力以及NF-κB p65 的表达水平均显著降低，表明斑蝥素抑制VSMC 迁移与其抑制NF-κB 信号通路的激活密切相关。本研究还发现，与PDTC 组比较，斑蝥素组VSMC 迁移能力更弱，推测斑蝥素在抑制VSMC 迁移的过程中可能还涉及NF-κB 信号通路以外的其它通路。

VSMC 迁移的前提条件是细胞外基质（ECM）和基底膜的降解[18]。基质金属蛋白酶（MMP）能特异性与ECM 相结合并降解ECM 成分，从而促进VSMC迁移至血管内膜[19]。MMP-9 作为MMP 家族中的重要成员，在基质降解、VSMC 迁移等过程中起重要作用[20-21]。本研究结果显示，含有斑蝥素的不同组别中MMP-9 的表达均有所降低，推测斑蝥素抑制VSMC 的迁移与其抑制VSMC 中MMP-9 表达有关。

总之，本研究表明，斑蝥素可显著抑制脂多糖诱导的VSMC 迁移以及球囊损伤大鼠颈总动脉新生内膜的过度增生；而发挥作用的机制至少与斑蝥素抑制NF-κB 信号通路介导的炎性反应有关。这为进一步研究斑蝥素对VSMC 的生物学活性作用奠定了基础，为治疗与VSMC 迁移功能密切相关的动脉粥样硬化及血管再狭窄提供了理论基础。