miR-210表达在老年COPD合并缺血性脑卒中患者中的研究

王乐强，徐丽娜，高程鹏，张翼翔，邱立洁

(潍坊市人民医院 呼吸内科,山东 潍坊）

0 引言

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系统最为常见的疾病之一，占所有老年人群发病率10～15%，最终进展为呼吸衰竭和心力衰竭[1]。脑血管疾病已成为威胁全人类健康的首要疾病，具有高发病率、高致残率和高死亡率特点，其中70～85%为缺血性脑卒中。据统计，我国每年新发老年COPD合并缺血性脑卒中患者约 200～350万，死亡率约 30～55%[2]。COPD 和缺血性脑卒中均是受遗传和环境共同作用的多因素、多基因慢性疾病，微小RNAs（miRNAs）在调控疾病的发生和发展中发挥重要作用，可能成为预防和治疗疾病的重要靶点。采用基因测序技术检测COPD患者循环血液中共有70多种miRNAs表达异常，缺血性脑卒中动物模型和在体临床研究得出，约89个miRNAs表达明显下调，35个明显上调，并随病情进展表现一定的变化趋势。在众多的miRNAs中，miR-210表现的最为稳定而显著。miR-210与多种呼吸系统疾病，包括感染性肺炎、肺纤维化、哮喘、COPD、肺结核和肿瘤等均有密切关系。在缺血性脑卒中动物模型中证实[3]，miR-210在缺血/缺氧条件下，可参与细胞增殖和细胞周期的调控、诱导血管新生、促进神经再生等。基于此，该研究旨在分析miR-210在老年COPD合并缺血性脑卒中患者中的表达水平，并分析其作为敏感诊断指标的应用价值。

1 对象与方法

1.1 对象资料

连续选择2016年01月至2018年01月入我院60例老年COPD合并缺血性脑卒中患者（A组），60例单纯老年COPD患者（B组），60例缺血性脑卒中患者（C组）和60例健康志愿者（D组）。纳入标准：（1）COPD急性和稳定期，缺血性脑卒中急性期；（2）年龄65～80岁；（3）入院治疗前采集数据，完整可分析。排除标准：（1）合并肺部其他疾病，如肺癌、肺炎、哮喘、呼吸衰竭等，缺血性脑卒中稳定期，其他脑源性疾病，如出血性脑卒中、脑肿瘤、脑炎等；（2）合并其他基础疾病，如心、肝、肾等脏器功能障碍，自身免疫性疾病，全身感染性疾病，传染性疾病等。

该研究取得我院伦理委员会通过及患者、家属的知情同意权，其中A组男性26例，女性24例；年龄66～78岁，平均（72.3±10.2）岁；COPD病程1～8年，平均（4.2±2.5）年；COPD急性期24例，稳定期 26例；缺血性脑卒中病程 0.5～3h，平均（1.3±0.6）h；合并高血压12例，糖尿病6例，吸烟20例。B组男性25例，女性25例；年龄 68～79岁，平均（73.5±12.4）岁；COPD 病程 2～9年，平均（4.6±2.4）年；COPD急性期23例，稳定期27例；合并高血压13例，糖尿病5例，吸烟22例。C组男性24例，女性26例；年龄68～80岁，平均（73.6±12.5）岁；缺血性脑卒中病程 1.0～3.5h，平均（1.6±0.8）h；合并高血压14例，糖尿病8例，吸烟16例。D组男性26例，女性24例；年龄67～80岁，平均（73.8±11.8）岁；合并高血压16例，糖尿病7例，吸烟19例。组间的基线资料具有可比性。

1.2 研究方法

采用实时定量PCR法检测外周血miR-210的表达水平，采用日本HI-801型便携式肺功能仪检测病情稳定后的肺功能。

PCR 法主要仪器：9600 型 PCR 扩增仪（美国 ABI 公司），RTPCR 检测仪（美国 Bio-Rad 公司），BCM-8 超净工作台（北京六一厂），微量移液器（德国 Eppendorf 公司）。

主要步骤：抽取外周肘静脉血5mL，3000g离心20min后-20℃保存待检。应用美国Invitrogen公司提供的AM1556试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计（美国 Bio-tek 公司）测定 RNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳测定 RNA 完整性。美国Media Cybernetics公司提供的TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 试剂盒合成cDNA，引物设计（美国应用生物系统公司）：miR-210（F）：5’- TGCGGCTGTGCGTGTGACAG-3’，(R)：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’; 应用小鼠 hsa-miR -16(5’-UA GCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’)作为内参基因。反应体系：1:20RT 产物 cDNA 5.0 μL+ 5 pmol/μL PCR 正负向引物各 0.5 μL+2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL 加水至 20 μL。反应条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 15 s、65 ℃ 退火 15 s、72 ℃ 延伸32 s，共40个循环，融解曲线分析温度 60 ℃-95 ℃。结果以目的基因与内参基因比值表示，采用2-⊿⊿Ct法。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素ANOVA分析，两两比较采用LSD法检验，计数资料以率表示，组间比较用χ2检验；miR-210诊断的敏感性和准确性采用受试者工作曲线（ROC）分析；P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组间miR-210水平的比较

A组的miR-210水平最低，其次为B组和C组，D组最高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

120例 COPD患者的肺功能结果显示，FEV1/FVC＞0.7，FEV1≥ 0.8共 22例（肺 功 能 减 退 倾 向）；FEV1/FVC≤ 0.7，FEV1≥0.8共42例（轻度肺功能减退）;FEV1/FVC≤0.7，FEV1在0.5～0.8共 38例（中度肺功能减退）;FEV1/FVC≤0.7，FEV1在0.3～0.5共 12例（重度肺功能减退）;FEV1/FVC≤0.7，FEV1＜0.3共6例（特重度肺功能减退）。miR-210水平随肺功能减退程度加重而降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图1 组间miR-210水平的比较注：A组，老年COPD合并缺血性脑卒中；B组，老年COPD;C组，缺血性脑卒中；D组，健康志愿者）

图2 不同肺功能的miR-210水平比较（1为C组和D组，2为肺功能减退倾向，3为轻度肺功能减退，4为中度肺功能减退，5为重度肺功能减退，6为特重度肺功能减退）

2.2 ROC曲线分析

以COPD为诊断标准，采用ROC曲线分析得出：miR-210的诊断敏感性85.6%，特异性72.6%，准确性（曲线下面积）0.821,95%CI为0.632～0.924；以缺血性脑卒中为诊断标准，miR-210的诊断敏感性81.2%，特异性78.3%，准确性0.802，95% CI为0.635～0.945，见图 3。

图3 miR-210诊断COPD和缺血性脑卒中的ROC分析

3 讨论

miRNAs可以与目标靶mRNA 3’ 端非翻译区结合，使转录后的基因表达沉默，在发育、细胞分化、增殖和凋亡等生物学过程中发挥重要作用。COPD的发生与环境污染和吸烟密切相关，研究证实，miR-210在COPD患者中表达下调，增加PGE2的表达；在缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的诱导下，p53基因表达增强，miR-210表达降低，与HIF-1α呈正相关，调控AKT的失活[4]；p53基因可调控miR-210在DNA损伤反应中的表达，抑制DNA修复过程[5]。通过该研究得出：COPD合并缺血性脑卒中组的miR-210水平最低，其次为COPD组和缺血性脑卒中组，健康志愿者组最高，差异有统计学意义。进一步分析，miR-210水平随肺功能减退程度加重而降低，差异有统计学意义。ROC分析得出：miR-210诊断COPD的敏感性85.6%，特异性72.6%，准确性0.821。证实，miR-210在COPD中表达下调，与病情严重程度相关，可作为疾病诊断的敏感性指标。

缺血性脑卒中的发生、发展和神经修复过程中，miR-210对细胞增殖和细胞周期的调控可通过下调细胞增殖蛋白表达，其中E2F3是直接靶点，在DNA复制的过程中E2F3调控细胞周期从G1过渡到S期，促进细胞增殖；此外，FGFRL1和HOXA1也是miR-210作用的蛋白质靶点，HOXA1的过度激活可活化P44/42MAP激酶，促进细胞增殖。miR-210可下调促凋亡半胱氨酸蛋白酶8（Caspase-8）的表达，提高间充质干细胞的存活[6]。miR-210诱导血管新生依赖于Dicer基因的表达，miR-210是血管内皮细胞存活、迁移的关键调节因素。正常的血管内皮细胞中miR-210呈过表达，通过下调靶基因ephrinA3的表达促进血管新生。研究证实，miR-210的表达水平与缺血性脑卒中的严重程度相关。miR-210促进神经再生的机制是通过抑制半胱天冬酶的活性来抑制神经元的凋亡，调控bcl-2和bax水平的平衡[7]。通过该研究得出：COPD合并缺血性脑卒中组的miR-210水平比单纯COPD和缺血性脑卒中更低，提示miR-210与COPD和缺血性脑卒中的发病均相关。ROC分析得出， miR-210诊断缺血性脑卒中的敏感性81.2%，特异性78.3%，准确性0.802.提示，miR-210在缺血性脑卒中表达下调，可作为疾病诊断的敏感性指标。

综上所述，miR-210在COPD和缺血性脑卒中表达下调，可作为诊断COPD和缺血性脑卒中的敏感性指标。