波形蛋白（Vimtentin）及肌球蛋白重链-9（Myosin-9）在膀胱癌中的表达及临床意义

迟庆龙，张守利，张璐，刘立民，戴小凡，张尧，王超，杨丹钰，刘艳玫

（吉林市中心医院，吉林 吉林）

0 引言

膀胱癌是泌尿系统的常见肿瘤疾病，且男性发病率明显高于女性，有报道称全球范围内每年新发病例43万，发病率仍存在上升趋势[1]。有文献报道称，原发性膀胱癌5年生存率为33%，而一旦发生膀胱尿路上皮转移则降到5.4%[2]，因此，积极并及时评判膀胱癌分期有重要的临床意义。波形蛋白（Vimtentin）是细胞骨架的重要组成蛋白之一，已有研究证实Vimtentin在膀胱癌组织中呈高表达，但并未对其与临床病理特征的关系进行探讨[3]。Myosin-9是上皮细胞非肌肉型肌球蛋白之一，与细胞的分化和迁移密切相关，但尚未见其与膀胱癌临床病理分期的相关报道[4]。本研究探讨Vimtentin及Myosin-9 mRNA及其蛋白在膀胱癌及癌旁组织中的表达，及其与膀胱癌患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年6月至2019年11月吉林市中心医院收治的膀胱癌患者60例，年龄（46～68）岁，其中男41例，女19岁，于术中取膀胱癌组织及癌旁组织样本（距膀胱癌组织＞2cm）；癌肿为单发28例，多发32例，病理分级：I级16 例、Ⅱ级21例、Ⅲ级23例；临床分级：Ta～T1 25例，T2～T4 35例。已淋巴结转移26例，无淋巴结转移34例。入组患者均为初诊，并未接受化疗、放疗、中药及靶向治疗。本研究通过吉林市中心医院伦理委员会同意，所有入组患者签署知情同意书。

1.2 Real-time PCR检测Vimtentin及Myosin-9 mRNA在膀胱癌组织中的表达

Vimtentin及Myosin-9 mRNA引物由沈阳万类生物有限公司合成，应用FTC3000型Real-time PCR仪按照RNA试剂盒说明完成血清总RNA的提取，并采用紫外分光度测定其浓度及纯度；建立反转录体系，将 cDNA 模板 11 μL、上下游引物 10 μmol·L-1各0.5 μL加入赛博绿PCR反应液中（10 μL）进行PCR循环，反应结束后经 95 ℃（10 min），60℃（25 s），72℃（40 s），4℃（5 min）温度阶梯，循环40次后每个基因样品行3个孔平行试验，实验结果采用2-△△CT法分析数据。

1.3 Western blot 检测Vimtentin及Myosin-9蛋白在膀胱癌及癌旁组织中的表达

取膀胱癌及癌旁组织冷冻后，将入组患者膀胱癌及癌旁组织进行共同冷研磨，并用BCA法测定样本胞蛋白浓度，取各组待测样品10 μL和5 μL蛋白Marker，加入至SDS-PAGE电泳装置中，进行电泳，转膜，脱脂牛奶TBST缓冲液封闭，加入Vimtentin及Myosin-9蛋白一抗（1：1000），4℃孵育过夜，TBST洗膜 3次，加入二抗（1：1000）稀释，室温孵育，TBST洗膜3次，ECL显像后于暗室曝光，用凝胶图象处理系统分析。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/内参β-actin的灰度值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 膀胱癌及癌旁组织中Vimtentin及Myosin-9 mRNA表达情况

与癌旁组织比较，膀胱癌肿瘤组织中Vimtentin及Myosin-9 mRNA表达升高[（2.63±0.37） vs （0.64±0.08），（3.67±0.26） vs（0.45±0.04）]，差异有统计学意义（tVimtentin=40.718，PVimtentin＜0.001；tMyosin-9=97.465，PMyosin-9＜0.001）。

2.2 膀胱癌及癌旁组织中Vimtentin及Myosin-9蛋白表达情况

与癌旁组织比较，膀胱癌组织中Vimtentin及Myosin-9蛋白表达升高，差异有统计学意义（tVimtentin=28.624，PVimtentin＜0.001；tMyosin-9=41.636，PMyosin-9＜0.001）。见图 1。

2.3 Vimtentin及Myosin-9 mRNA与膀胱癌患者临床病理特征关系

不同性别、年龄、肿瘤数目、肿瘤直径膀胱癌肿瘤组织中Vimtentin及Myosin-9 mRNA无明显差异，无相关性（P＞0.05）；与膀胱癌患者临床病理分期、临床分期及转移相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

图1 膀胱癌及癌旁组织中Vimtentin及Myosin-9蛋白

表1 膀胱癌患者肿瘤组织中Vimtentin及Myosin-9 mRNA与临床病理特征关系（±s）

表1 膀胱癌患者肿瘤组织中Vimtentin及Myosin-9 mRNA与临床病理特征关系（±s）

项目 例数 Vimtentin mRNA Myosin-9 mRNA Vimtentin t值 P值 Myosin-9 t值 P值年龄/岁＞55 37 2.68±0.35 0.907 0.368 3.74±0.52 0.447 0.656≤55 23 2.59±0.41 3.68±0.48性别男41 2.66±0.42 0.382 0.704 3.69±0.38 -0.568 0.572女19 2.61±0.57 3.76±0.56肿瘤数目单发 28 2.59±0.52 -0.678 0.500 3.65±0.43 -0.483 0.63多发 32 2.69±0.61 3.71±0.52肿瘤直径/cm＞2 37 2.58±0.48 -0.613 0.542 3.62±0.64 -0.667 0.508≤2 23 2.68±0.51 3.73±0.59病理分级G1 16 2.42±0.35 -4.501 ＜0.001 2.67±0.25 -11.433 ＜0.001 G2～G3 44 2.97±0.44 4.39±0.58临床分期Ta～T1 19 2.16±0.39 -7.708 ＜0.001 2.85±0.41 -9.098 ＜0.001 T2～T4 41 3.21±0.53 4.33±0.65转移情况是26 2.31±0.45 -6.702 ＜0.001 2.93±0.36 -10.264 ＜0.001否34 3.06±0.37 4.16±0.57

3 讨论

Vimtentin在正常细胞中均有一定量的表达，是组成细胞骨架的重要部分，而在上皮源性肿瘤中Vimtentin过度表达则提示肿瘤细胞可能出现上皮间质转化的特征，使肿瘤细胞失去上皮表型，变为有较强活动能力，在细胞基质间自由穿梭的“恶性杀手”[5]。因此，在多种肿瘤细胞中Vimtentin过表达均提示肿瘤细胞可能存在转移、浸润的发生[6-7]。Myosin-9是肌球蛋白Ⅱ重链家族的亚单位，其与细胞迁移、骨架维持、细胞-细胞粘附相关，但其在不同的肿瘤细胞中表达作用并不相同[8]。已有研究显示，Myosin-9在肺癌及胃癌中呈高表达，并且与肿瘤细胞的侵袭和转移有关[4,9]。但另有报道称，Myosin-9在鳞状细胞癌中对肿瘤的发展起抑制作用[10]。这可能与不同肿瘤分化程度不同，导致Myosin-9在不同肿瘤细胞中的作用亦不相同。

膀胱癌的发生具有较高的复杂性，其与环境因素、基因突变、糖尿病、吸烟等多种因素有关[11-12]。本研究通过Real-time PCR对膀胱癌肿瘤组织及癌旁组织进行检测，证实膀胱癌肿瘤组织中Vimtentin及Myosin-9 mRNA表达高于癌旁组织，说明Vimtentin及Myosin-9 mRNA的表达可能参与了膀胱癌的发生。而Western blot结果显示，膀胱癌肿瘤组织及癌旁组织Vimtentin及Myosin-9蛋白表达趋势与其对应mRNA表达趋势相同，说明Vimtentin及Myosin-9不仅通过调控其对应蛋白mRNA对膀胱癌的发生进行影响，其蛋白的表达亦在该疾病的发生中起到一定作用。本研究通过统计Vimtentin及Myosin-9 mRNA与膀胱癌患者特征关系发现，Vimtentin及Myosin-9 mRNA表达与临床病理分期、临床分期及淋巴转移相关，与性别、年龄、肿瘤数目、肿瘤直径无相关性，说明Vimtentin及Myosin-9 mRNA可能通过调控细胞上皮间质转化及细胞极性、细胞分裂能力，促进膀胱癌细胞浸润和转移。

综上所述，Vimtentin与Myosin-9 mRNA及对应蛋白在膀胱癌组织中均呈高表达，且与肿瘤临床分期及转移相关，有可能成为膀胱癌进展情况的临床参考标记物。