不同来源乳中α乳白蛋白、β乳球蛋白和乳铁蛋白含量分析

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(1.北京城市学院生物医药学部,北京 100083;2.北京市营养源研究所,北京 100069)

乳蛋白主要分为两大类:酪蛋白和乳清蛋白,牛乳蛋白中酪蛋白含量约为80%,乳清蛋白含量约为20%。乳清蛋白在婴儿的免疫系统调节、肌肉组织建立等起到了很重要的辅助作用[1-2]。乳清蛋白称作蛋白之王,它是一种从奶类中提取的高营养、易吸收、内含多种活性成分的蛋白质,是世界公认的人体优质蛋白质补充剂之一[3-4]。乳清蛋白的主要成分包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白、乳过氧化物酶等。这些成分是人体中免疫系统的防御机制的一部分,在抑菌、抗病毒和调节人体免疫循环等方面发挥了积极作用[5-6]。

β-乳球蛋白是牛乳中的主要乳清蛋白,约占乳清蛋白的50%,是由162个氨基酸残基、2个二硫基团(S-S)和1个硫氢基团(-SH)组成的一种分子量约18.3 kDa的小的球状蛋白。β-乳球蛋白与叶酸结合,可以有效地增强其稳定性;与脂溶性维生素和脂肪酸等结合,可以改善产品的风味、促进营养物质的吸收;β-乳球蛋白也可以延缓某些脂肪酸和维生素的氧化降解,起到保护作用[7]。

α-乳白蛋白是乳清蛋白中第二丰富的组分,占牛乳清蛋白的20%。α-乳白蛋白在乳腺中合成,在乳糖的生物合成上作为辅酶参与作用[8]。α-乳白蛋白控制着乳腺中乳糖的含量,是泌乳阶段的一个重要调节因子。另外,α-乳白蛋白也是必需氨基酸色氨酸和半胱氨酸的良好供体[9]。

表1 不同来源及加工方式的乳样品Table 1 The milk samples from different sources and processing methods

乳铁蛋白是乳清蛋白中的一种重要的非血红素铁结合糖蛋白,它是母乳中重要的具有多种生理活性的铁结合糖蛋白[10],约占母乳乳清蛋白的26%,乳铁蛋白因其独特的结构及生物学功能,在强化机体铁吸收、对抗病原体、免疫调节以及抗氧化等方面发挥着重要作用[11-12]。但并非乳汁所特有,在哺乳动物的很多外分泌物中都存在,如眼泪、唾液和精液等[13]。只是除乳中外,其他分泌物中含量甚微。因其晶体呈红色,故也有学者称之为红蛋白[14]。乳铁蛋白具有很多对人体有益的功能:抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等[15]。因此,被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂,越来越多的受到国内外相关企业及研究者的重视[16]。我国在GB14880-2012《食品营养强化剂使用标准》将乳铁蛋白列为了新型营养强化剂,并规定了其在相关乳制品中的含量标准。目前,我国并没有建立相应的检测标准[17-18]。

近年来随着人们生活水平的提高,人们对乳及乳制品的需求量也越来越大,除了牛乳,羊乳、牦牛乳等乳制品也逐渐流入市场。目前系统地对不同来源不同物种奶中乳清蛋白的研究并不多,本研究采用高效液相色谱法串联质谱外标法测定不同来源的羊乳、牦牛乳、牛乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白含量,分别分析其在不同乳中的差异。为婴幼儿配方奶粉等食品加工提供数据基础和技术思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

碳酸氢铵、氯化钙、乙酸、硫酸、氢氧化钠 均为分析纯,北京化工厂;色谱纯甲酸、乙腈 赛默飞世尔科技有限公司;二流苏糖醇(DTT) Solarbio公司、碘代乙酰胺(IAA) Solarbio公司、牛胰蛋白酶(SIGMA公司);牛乳铁蛋白特异肽段VDSALYLGSR、α-乳白蛋白特异肽段VGINYWLAHK、β-乳球蛋白特异肽段TPEVDDEALEK 纯度≥95%,由宁波康贝生化有限公司制备。

UPLC I-CLASS XEVO液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪(带电喷雾离子源) WATERS公司;TQCP124C全自动电子天平(十万分之一) 日本A&D公司;MVS-1漩涡混合器 北京金北德工贸有限公司;Easypure纯水系统 美国Barnstead公司;PS-60A超声波振荡器 深圳市深华泰实业有限公司；ZHWY-110X30往复式恒温水浴摇床 上海智城分析仪器制造有限公司；KJ2300全自动凯氏定氮仪 FOSS公司。

1.2 试验方法

1.2.1 乳类样品的采集与处理 本研究通过市场采购和网购方式采集到来自不同产地包括巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳共24种,其中牛乳15种、羊乳6种、牦牛乳3种。详情见表1。奶样采集后4 ℃保存,3 d内测定。

1.2.2α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的测定 乳类样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量检测方法参考液相色谱质谱法[19-22]进行检测。

1.2.2.1 样品预处理 称取2.5 g样品溶液于100 mL容量瓶中,用水稀释定容至刻度,混匀。移取200 μL稀释液于小试管中,加入180 μL碳酸氢铵溶液,混匀,加入15 μL二硫苏糖醇溶液,50 ℃恒温反应30 min,取出冷却,加入45 μL碘代乙酰胺溶液,避光静止30 min,加入10 μL氯化钙溶液和40 μL胰蛋白酶溶液,37 ℃恒温酶解4 h,取出后加入10 μL甲酸,室温静止30 min,最后加入适量水,使酶解液总体积为1.0 mL,混匀后过0.22 μm滤膜,即为待测样品供试液,供液相色谱质谱测定。

1.2.2.2 液相条件 色谱柱:硅烷基C18柱;流动相A:0.1%甲酸水溶液;流动相B:0.1%甲酸乙腈溶液;流动相流动速度:0.3 mL/min;色谱柱柱温:40 ℃;试液温度:10 ℃;进样体积:5 μL。

1.2.2.3 质谱条件 毛细管电压3.5 kV,锥孔电压35 kV,脱溶剂温度500 ℃,脱溶剂气流量800 L/min,锥孔反吹气流量30 L/hr,碰撞室压力3.0×10-3mbar,低端分辨率1:2.5 V,高端分辨率1:15.0 V,离子能量1:0.5,低端分辨率2:2.8 V,高端分辨率2:15.0 V,离子能量2:1.0,离子源温度:150 ℃,提取器压力:3.0 V,入口透镜电压:0.5 V,碰撞梯度:1.0。

1.2.2.4 定性定量条件α-乳白蛋白特异肽段分子量1199.65,母离子为[M+2H]2+为601,子离子为355.2+/284.2+;β-乳球蛋白特异肽段分子量1244.50,母离子为[M+2H]2+为623.2,子离子为819.3+/918.4+。乳铁蛋白特异肽段分子量1079.6,母离子为[M+2H]2+为540.9,子离子为595.3+/319.3+。

α-乳白蛋白分子量为14178、β-乳球蛋白分子量为18320、乳铁蛋白分子量为76095.1,采用特异肽段外标法定量。

乳清蛋白含量(g/100 g)=[α-乳白蛋白含量(g/100 g)+β-乳球蛋白含量(g/100 g)]/系数(60%)。

1.2.3 不同乳中总蛋白含量 牛乳、羊乳、牦牛乳总蛋白含量采用GB 5009.5-2016食品中蛋白质的测定中第一法:凯氏定氮法进行测定。

1.3 数据处理

通过实验收集到的原始数据经过Microsoft Office Excel 2013和SPSS 22.0整理分析。

2 结果与分析

2.1 α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白定量测定方法

本文采用酶解法同时测定乳品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量,以各功能蛋白的特异肽段定性定量子离子峰面积为横坐标,浓度为纵坐标,得到标准曲线,各标准曲线方程相关系数均大于0.99,可满足定量测定需要。各功能蛋白液相条件能够很好的分离,如图1～图3。

图1 α-乳白蛋白特异肽段谱图Fig.1 α-lactoalbumin specific peptide segment spectrum

图2 β-乳球蛋白特异肽段谱图Fig.2 β-lactoglobulin specific peptide segment spectrum

图3 乳铁蛋白特异肽段谱图Fig.3 Lactoferrin specific peptide segment spectrum

2.2 不同乳品中乳清蛋白含量比较

采集的牛、羊、牦牛乳样品均以三平行平均值进行统计,羊奶乳清蛋白含量在0.287～0.484 g/100 g,牦牛奶乳清蛋白含量在0.447～0.601 g/100 g,牛奶乳清蛋白含量在0.454～0.578 g/100 g。通过对羊、牦牛、牛乳测定的乳清蛋白含量占总蛋白比分析后,可以看出三种乳类中的乳清蛋白量差异不明显。其中,牛奶中的乳清蛋白量占总蛋白比例在三种乳类中最高(均值为16.2%),然后依次是牦牛乳(均值为14.81%)和羊乳(均值为13.28%)。乳清蛋白的实验数据见表2。各个乳类测定的乳清蛋白占总蛋白比较见图4。

图4 不同乳品中乳清蛋白占总蛋白比例Fig.4 The percentage of whey protein content to total protein in different milk products

表2 不同乳品中乳清蛋白含量Table 2 Contents of whey protein in different milk samples

2.3 不同乳品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量比较

2.3.1 不同羊奶样品间α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量 由图5可得,同一样品间数据平行性很好,但不同样品间波动性较大,所以做羊奶整体平均数时采用舍极值取平均的公式计算,保障羊奶中蛋白含量的普遍性。结果得到羊奶中α-乳白蛋白含量在0.113～0.213 g/100 g范围;而β-乳球蛋白含量约在0.110～0.174 g/100 g范围内。

图5 不同羊乳样品间α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量Fig.5 Contents of α-lactoalbumin and β-lactoglobulin in different samples of goat milk

2.3.2 不同牦牛乳样品间α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量 牦牛乳乳清蛋白样品间α-乳白蛋白和β-乳球蛋白测定结果比较见图6。从图中可知,不同牦牛乳样品间存在较大差异,牦牛乳中α-乳白蛋白的含量范围在0.118～0.207 g/100 g;β-乳球蛋白的含量范围在0.150～0.178 g/100 g。

图6 不同牦牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量Fig.6 Contents of α-lactoalbumin and β-lactoglobulin in different yak milk

2.3.3 不同牛乳样品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量 由图7可看出,同一样品间的三组数据平行性较好,但个别数据出现了单组差异性较大,并且不同样品间β-乳球蛋白差异较大,所以在牛奶整体取平均数时,也采用舍极值取平均来保障牛奶中蛋白含量的普遍性。牛奶中α-乳白蛋白的含量在0.121～0.205 g/100 g范围内;β-乳球蛋白含量在0.120～0.193 g/100 g范围内。

图7 不同牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量Fig.7 Contents of α-lactoalbumin and β-lactoglobulin in different milk

由于人乳与其他乳品的蛋白质构成存在差异,再加上婴儿肠道和免疫系统发育尚不成熟,有一部分婴儿会对乳品过敏。研究表明,β-乳球蛋白是牛乳的主要过敏原[22],本研究显示,羊乳中β-乳球蛋白的含量最低,牦牛乳次之,牛乳最高,因此羊乳较牦牛乳、牛乳较更不易引起婴儿过敏。

2.4 不同来源乳中乳铁蛋白含量比较

由表3可以看出,羊奶乳铁蛋白含量在2.15～9.90 mg/100 g,牦牛奶乳铁蛋白含量在2.21～2.65 mg/100 g,牛奶乳铁蛋白含量在1.21～3.27 mg/100 g。通过对三种乳类测定出的乳铁蛋白含量占其总蛋白含量的比例分析,可得羊乳中的乳铁蛋白含量最高,牦牛乳和牛乳的乳铁蛋白量相差不多。如图8可以看出,乳铁蛋白占总蛋白比例由多到少依次是羊乳(约总蛋白量占0.124%)>牦牛乳(约总蛋白量占0.07%)>牛乳(约总蛋白量占0.06%)。本研究中羊乳中乳铁蛋白浓度稍高,不同来源样品间差异较大,可能与农场的养殖水平、饲料、饲养环境有关。

图8 不同乳品中乳铁蛋白占总蛋白比例Fig.8 The percentage of lactoferrin content to total protein in different milk products

表4 不同来源乳品α-乳白蛋白含量、β-乳球蛋白含量和乳铁蛋白含量差异性分析Table 4 Differentiation of the contents of α-lactoalbumin,β-lactoglobulin and lactoferrin in milk from different sources

表3 不同乳品中乳铁蛋白含量Table 3 Contents of lactoferrin in different milk samples

2.5 不同来源乳品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量比较

本文采集到牦牛乳、牛乳和羊乳共3种类型乳品。经检测分析,3个地区的牦牛乳中α-乳白蛋白含量差异很大,最小值为0.118 g/100 g、最大值为0.207 g/100 g;β-乳球蛋白含量在3个地区牦牛乳中含量一致。15个牛乳中α-乳白蛋白含量差异较大,其范围在0.121～0.205 g/100 g;β-乳球蛋白含量与α-乳白蛋白含量范围接近,在0.120～0.193 g/100 g。6个羊乳样品测定结果显示,α-乳白蛋白含量大于牦牛乳和牛乳,在0.113～0.213 g/100 g,β-乳球蛋白含量差异不显著,范围在0.110 g/100 g～0.174 g/100 g。

3种类型乳品乳铁蛋白含量差异显著,含量范围在1.21～9.90 mg/100 g(表3)。3个地区的牦牛乳中乳铁蛋白含量一致,在2.21～2.65 mg/100 g。15个牛乳中乳铁蛋白含量在1.21～3.27 mg/100 g。羊乳中乳铁蛋白含量差异最显著,最低值为2.15 mg/100 g,最大值为9.90 mg/100 g。总体来看,羊乳中乳铁蛋白含量优于牛乳和牦牛乳。

3 结论

本研究对24种市售乳品的测定得到,不同来源乳品的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白、乳铁蛋白和总蛋白含量存在差异。牦牛乳和牛乳的乳清蛋白含量接近,羊乳中乳清蛋白含量相对较低。但是,羊乳却是良好的乳铁蛋白来源,在三类乳源中含量最高。牦牛乳总蛋白含量明显高于牛乳和羊乳。

GB 10765-2010规定,婴儿奶粉中乳清蛋白含量要大于总蛋白的60%。本研究乳清蛋白含量和乳清蛋白占总蛋白比例结果可以为婴儿乳粉等产品中乳清蛋白来源提供数据支持,乳铁蛋白含量结果可以筛选更适宜的营养强化剂乳铁蛋白原料来源。