慢性乙型肝炎患者外周血T 淋巴细胞程序性死亡受体1表达与HBV-DNA 水平的相关性

谢 巍，赵 川，王 容，王文平，涂 宏

（1）四川省遂宁市中心医院消化内科；2）心血管三病区，四川遂宁 629000）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）为临床常见肝脏疾病，由乙型肝炎病毒（HBV）持续感染引起，调查显示，我国CHB 患者人数为3 000万左右[1]。研究认为，HBV 持续感染的原因与患者T 淋巴细胞功能低下有关[2]。相关资料指出，T 淋巴细胞数量和质量上的缺陷会使HBV 难以有效清除，继而导致疾病慢性化[3]。程序性死亡受体1（PD-1）是近年来发现的一种分子量为55KD 的单体I 型跨膜蛋白，为CD28 分子家族成员，可与程序性死亡配体1（PDL-1）结合，阻断CD28 分子介导激活磷酸肌醇3 激酶途径，继而抑制T 淋巴细胞增殖与分化，减弱T 淋巴细胞功能[4-5]。随着对细胞免疫学的深入研究，部分学者认为CHB 的发生与发展可能与PD-1 有关[6]。本次研究以遂宁市中心医院92 例CHB 患者为研究对象，分析CHB 患者外周血T 淋巴细胞PD-1 水平，并探讨其与HBV-DNA 的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取遂宁市中心医院2016 年1 月至2019 年3月收治的92 例CHB 患者为研究对象，均符合中华医学会感染病学分会颁布的《慢性乙型肝炎防治指南》（2015 版）[7]中CHB 诊断标准，排除合并其他类型肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、酗酒史、血液系统疾病和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者，且本次研究前6 个月未进行过抗病毒和免疫治疗，所有患者均自愿参与本次研究。92 例CHB 患者中男55 例，女37 例；年龄25～70 岁，平均（45.69±10.73）岁。另选择60 例健康志愿者作为对照组，其中男36 例，女24 例；年龄22～64岁，平均（43.75±9.18）岁。

1.2 方法

外周血T 淋巴细胞PD-1 检测：取两组受检者新鲜EDTA 抗凝全血，加入CD4-FTTC 或CD8-FTTC、PD-1-PE 或其相应同型对照抗体（均由美国eBioscience 公司提供），于4℃环境中避光孵育20 min，之后加入500 μL 红细胞裂解液（由美国BD 公司提供），再于4℃环境中避光孵育10 min，加入1 000 μL磷酸盐缓冲溶液，以500×g 的转速离心5 min，洗涤后使用流式细胞仪（由美国BD 公司提供）检测。

HBV-DNA 水平检测：采用荧光定量PCR 检测，试剂盒由上海申友生物技术有限公司提供，PCR 仪由美国Applied Biosystems 公司提供，型号为ABI PRISM 7500 型。抽取患者外周静脉血3 mL，以4 000 r/min 的速度离心5 min，置于-80℃环境中冷冻备用。取PCR 反应管，将实验试剂与HBV 定量检测试剂盒试剂置于室温下解冻，之后将其混匀。取50 μL血浆标本，加入等量DNA 提取液，混匀，将混合液置于100℃环境中静置10 min，再在4℃环境中静置10 h，待混合液完全裂解，以13 000 r/min 的速度离心5 min，吸取2 μL上清液，加入至PCR 反应管，以6 000 r/min的速度离心30 s，取上清液置入PCR 基因扩增仪，93℃环境中预变性2 min，30 s 变性，55℃1 min退火，反复40 次，扩增仪扩增后进行结果宣读。所有操作过程均严格按照说明书进行，检测下限为1×103IU/mL。

1.3 统计学处理

2 结果

观察组和对照组外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达情况比较观察组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞PD-1 表达水平高于对照组（P＜0.05），见表1。

不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达情况比较92 例CHB 患者平均HBV-DNA 水平为（5.25±1.68）IgIU/mL，其中HBV-DNA 高水平组（＞6 IgIU/mL）34 例，HBV-DNA 中水平组（3～6 IgIU/mL）38例，HBV-DNA 低水平组（＜3 IgIU/mL）20 例。不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平均存在差异（P＜0.05），其中HBV-DNA 高水平组外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平高于HBV-DNA 中水平组和HBV-DNA 低水平组，HBV-DNA 中水平组外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平高于HBV-DNA 低水平组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1表达水平与HBV-DNA 水平的相关性分析CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平与HBV-DNA 水平均呈正相关（P＜0.05），见表3、图1～2。

表1 观察组和对照组外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达情况比较（）Tab.1 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in the observation group and the control group（）

表1 观察组和对照组外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达情况比较（）Tab.1 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in the observation group and the control group（）

表2 不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达情况比较（）Tab.2 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in CHB patients with different HBV-DNA levels（）

表2 不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达情况比较（）Tab.2 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in CHB patients with different HBV-DNA levels（）

与HBV-DNA 低水平组比较，*P ＜0.05；与HBV-DNA 中水平组比较，#P ＜0.05。

表3 CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平与HBV-DNA 水平的相关性分析Tab.3 The correlation between the expression levels of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes and HBV-DNA levels in patients with CHB

图1 CHB 患者外周血CD4+T 淋巴细胞PD-1 表达水平与HBV-DNA 水平散点图Fig.1 Scatter plot showing the expression level of PD-1 in peripheral blood CD4+ T lymphocytes and HBV-DNA level in patients with CHB

图2 CHB 患者外周血CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平与HBV-DNA 水平散点图Fig.2 Scatter plot showing the expression level of PD-1 in peripheral blood CD8+ T lymphocytes and HBV-DNA level in patients with CHB

3 讨论

HBV 为双链DNA 病毒，其入侵人体后会受到宿主免疫系统防御作用，HBV 特异性T 淋巴细胞会杀灭受感染细胞，继而抑制HBV-DNA 复制[8]。但由于个体对病毒免疫应答存在差异，故而形成HBV 感染不同转归。CHB 是HBV 持续感染导致，其发生原因与机体免疫功能异常有关，T 淋巴细胞免疫功能状态对HBV 清除程度起到重要作用。

PD-1 是在程序性死亡的T 淋巴细胞上发现的一种跨膜蛋白，可在活化的CD4+、CD8+T 淋巴细胞上进行诱导性表达。相关研究表示，PD-1 可抑制T 淋巴细胞，并诱导免疫耐受，当其与PDL-1结合后，会增强T 淋巴细胞线粒体内氧化反应，使得活性氧和过氧化氢水平升高，继而抑制T 淋巴细胞增殖，诱导其凋亡，削弱机体对病毒的免疫应答，诱导免疫逃逸[9-10]。众多研究显示，在HIV、丙型肝炎病毒（HCV）等病毒慢性感染患者中，其PD-1 表达均明显升高，而这与T 淋巴细胞功能受限相关[11-12]。肖健等[13]研究表明，HIV-1 感染患者外周血CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达明显高于健康人群，其认为PD-1 高度表达与HIV 感染患者CD8+T细胞功能受到抑制和免疫耗竭有关。本次研究分析CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达情况，显示观察组外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平高于对照组（P＜0.05），表明CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达增加。申红玉等[14]研究也表明，慢性HBV 感染患者CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平过高。

分析不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平，显示HBV-DNA 高水平组外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平＞HBV-DNA 中水平组＞HBV-DNA低水平组（P＜0.05），提示CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表 达 水 平 与HBV-DNA 水平存在一定关联性。进一步行Pearson 相关性分析，发现CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平与HBV-DNA 水平均呈正相关（r=0.527，r=0.568，P＜0.05）。分析原因，T 淋巴细胞增殖和分化受到PD-1/PDL-1通路的影响，水平下降，机体免疫防御机制越差，有利于HBV 复制，HBV-DNA 水平升高，且PD-1水平越高，T 淋巴细胞功能受限越严重，HBV 复制能力越强，HBV-DNA 水平越高。李志勤等[15]研究指出，对CHB 患者采用抗病毒治疗，其治疗后外周血CD8+T 淋巴细胞PD-1 表达水平明显下降，这也为本次研究结果提供佐证。

实验证实，对HBV 感染小鼠予以PD-1 抗体或PDL-1 抗体来阻断PD-1/PDL-1 通路，可增强抗病毒免疫作用[16-17]。相关研究表明，阻断PD-1/PDL-1 通路可以促进HIV-1 感染患者CD8+T淋巴细胞肿瘤坏死因子（TNF-α）和干扰素γ（INF-γ）分泌，而TNF-α 可促使被感染细胞凋亡，INF-γ 可进行免疫调节，认为PD-1 参与了CD8＋T 淋巴细胞功能抑制[13，18]。基于两种感染疾病PD-1 表达均过高，推测可通过阻断PD-1/PDL-1通路来增强机体免疫功能，但由于本次研究条件有限，未能对此进行探讨，可将此点作为后期研究内容[19-20]。

综上所述，CHB 患者外周血CD4＋、CD8＋T 淋巴细胞PD-1 表达增加，且会随着HBV-DNA 水平的升高而升高。CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞PD-1 的过表达与T 淋巴细胞功能受限有关，可考虑阻断PD-1/PDL-1 通路来恢复CD4+、CD8+T 淋巴细胞功能。