DA、5-HT 及MAO 在甲基苯丙胺和氯胺酮联合滥用依赖大鼠CPP 效应中的表达量变化

王一航，洪仕君，钟磊磊，解润芳，彭艳霞，李利华

（昆明医科大学法医学院，云南昆明 650500）

甲基苯丙胺（methamphetamine，MA），俗称冰毒，是一种人工合成的中枢神经兴奋剂，是当前滥用人数最多的毒品。氯胺酮（ketamine，KET）为苯环己哌啶衍生物，俗称“K”粉，是非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，为静脉麻醉药，具有一定的致幻效应和精神依赖性，已成为第二大滥用的合成毒品[1]。研究表明，MA 与KET 主要作用于中脑边缘多巴胺系统（mesolimbic dopamine system，MLDS），导致多巴胺（dopamine，DA）、五羟色胺（5-HT）等神经递质释放，使中脑边缘系统DA 浓度增加从而产生欣快感，使精神活动增强，致药物成瘾[2-4]。目前MA 与KET 联合滥用趋势严重，已成为当今全球最严重的公共卫生问题之一[5-6]。MA 和KET 联合滥用者出现的兴奋症状、精神病性症状和停药后的戒断期症状都比单一滥用者要严重[7-8]。因此，本研究旨在探讨甲基苯丙胺和氯胺酮联合滥用依赖大鼠DA、5-HT、MAO 的表达变化及其对大鼠条件位置偏爱的影响，对甲基苯丙胺、氯胺酮及两药联合滥用的精神依赖性和成瘾机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠，体重（200±20）g，由昆明医科大学实验动物学部提供。

1.2 药品及试剂

甲基苯丙胺盐酸盐（云南公安刑事科学技术研究所提供甲基苯丙胺片剂，由云南大学化学实验室提纯）；盐酸氯胺酮注液（云南双鹤医药有限公司，批号130221），所有药物用生理盐水溶解后配制成所需浓度，所有药物配制后放置4℃冰箱保存。

BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所）；大鼠多巴胺（DA）酶联免疫吸附测定试剂盒、大鼠单胺氧化酶（MAO）酶联免疫吸附测定试剂盒、大鼠五羟色胺（5-HT）酶联免疫吸附测定试剂盒（上海将来实业股份有限公司，货号JL12965、JL13513、JL13043）。

1.3 仪器

鼠博士·条件性位置偏爱视频分析系统（包括计算机、摄像头、RD1111-CPP-R1 实验箱体、动物行为学视频分析系统，版本V2.8.9.5）（上海移数信息科技有限公司）；超净工作台（苏州净化公司产品）；手持超声波细胞破碎仪（上海启前电子科技有限公司）；高速低冷离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；Synergy HT 酶标仪（美国Bio-Tek 公司）。

1.4 方法

1.4.1 甲基苯丙胺依赖大鼠模型的建立、分组和给药给药前用鼠博士·条件性位置偏爱视频分析系统对实验大鼠进行位置偏爱测定，将停留时间短的实验箱作为伴药箱。剔除对某一侧实验箱有明显偏爱的大鼠。

实验动物分组:取符合实验条件的36 只大鼠，按随机原则分为六个组:即（1）正常对照组（Sal组）；（2）甲基苯丙胺(2 mg/kg)组（MA 组）；（3）氯胺酮低剂量(15 mg/kg)组（K15 组）；（4）氯胺酮中剂量(30 mg/kg)组（K30 组）；（5）甲基苯丙胺＋氯胺酮低剂量(2 mg/kg+15 mg/kg)组（MK15组）；（6）甲基苯丙胺+氯胺酮中剂量(2 mg/kg+30 mg/kg)组（MK30 组）（联用组是药物混合同时给药）。

条件性位置偏爱实验（CPP）模型建立：（2）～（6）组奇数天上午（8:00）腹腔注射（ip）相应剂量药物，偶数天上午（8:00）ip 等体积生理盐水；（1）组每天上午（8:00）ip 同体积生理盐水；共计10 d。第11 天上午（8:00）进行条件位置偏爱检测。

1.4.2 ELISA 法检测脑内MAO、DA、5-HT 表达变化完成CPP 测定后，立即将各组大鼠麻醉后快速断头处死，根据包新民的大鼠脑立体定位图谱，冰上迅速分离前额叶皮质、伏隔核及中脑腹侧被盖区，-80℃保存备用。

将所取脑区精确称重后放入预冷的PBS（含有蛋白酶抑制剂）中在冰上进行匀浆，提取蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度，采用ELISA 法分别检测相关脑区MAO、DA、5-HT 的含量变化。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 行为学结果

2.1.1 与给药前比较Saline 组大鼠给药前后在伴药箱中的停留时间无明显变化（P＞0.05）；MA 组、K15 组、K30 组、MK15 组、MK30 组大鼠给药后在伴药箱中的停留时间均明显延长，差异有统计学意义（P＜0.01），表明MA 组、K15 组、K30 组、MK15 组、MK30 组大鼠经给药后，形成明显的条件性位置偏爱，大鼠CPP 模型成功建立，见表1。

2.1.2 与Saline 组比较MA 组、K15 组、K30组、MK15 组、MK30 组大鼠给药前后的伴药箱停留时间差均明显延长，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

2.1.3 单用药组与联合用药组比较与MA 组比较，MK15、MK30 联合用药组大鼠给药后在伴药箱中的停留时间增加，差异有统计学意义（P＞0.05）。与对应剂量的氯胺酮组比较，联用组大鼠给药后在伴药箱中的停留时间减少，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

表1 各组大鼠给药前后在伴药箱中的停留时间［s，（±s）］Tab.1 Duration of the stay of the rats in each group in the drug-paired compartment before and after the administration［s，（±s）］

表1 各组大鼠给药前后在伴药箱中的停留时间［s，（±s）］Tab.1 Duration of the stay of the rats in each group in the drug-paired compartment before and after the administration［s，（±s）］

与给药前比较，**P＜0.01，***P＜0.001。

图1 CPP 指数Fig.1 CPP Score

2.2 ELISA 检测结果

2.2.1 大鼠脑内DA 的含量如图2 所示，与MA组相比，MK15 组前额叶皮质，伏隔核DA 含量呈降低趋势，差异有统计学意义（P＜0.01）；MK30组伏隔核及中脑腹侧被盖区DA 含量呈降低趋势，差异有统计学意义（P＜0.001）。与K15 组相比，MK15 组伏隔核，中脑腹侧被盖区DA 含量都呈升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.001）。与K30组相比，MK30 组伏隔核DA 含量呈升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2.2 大鼠脑内5-HT 的含量如图2 所示，与MA 组相比，MK15 组前额叶皮质，伏隔核5-HT含量呈降低趋势，差异有统计学意义（P＜0.01）。与K15 组相比，MK15 组伏隔核5-HT 含量呈升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2.3 大鼠脑内MAO 的含量如图2 所示，与MA 组相比，MK15 组伏隔核及中脑腹侧被盖区MAO 含量呈降低趋势，差异有统计学意义（P＜0.01）；MK30 组伏隔核及中脑腹侧被盖区MAO 含量呈降低趋势，差异有统计学意义（P＜0.01）。与K15 组相比，MK15 组伏隔核，中脑腹侧被盖区MAO 含量呈升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图2 DA、5-HT、MAO 在前额叶皮质，伏隔核和中脑腹侧被盖区的表达情况Fig.2 Expression of DA，5-HT and MAO in prefrontal cortex，nucleus accumbens and ventral tegmental area

3 讨论

CPP 是评价心理依赖的经典模型[9]。本实验结果显示，与Saline 组大鼠相比，MA 组、K 组及MK 组大鼠均出现了明显的CPP 效应（有显著性差异），这表明无论是单独给药还是联合给药均可以诱导大鼠产生CPP 效应。此外，在同等KET 剂量下，MK 组伴药箱停留时间较KET 单用组短；MK组比KET 组产生的CPP 效应低，比MA 组产生的CPP 效应高（无显著性差异），表明联合给药可以诱导大鼠产生CPP 效应，但相对于单独用药，这种CPP 效应并没有显著提高，甚至发生了降低。有学者通过对斑马鱼的依赖模型研究发现，氯胺酮可以减弱甲基苯丙胺的CPP 效应[10-12]。单胺氧化酶（MAO）对DA、5-HT、去甲肾上腺素等单胺类神经递质具有高度亲和性，是DA 降解过程中的限速酶，在单胺类神经递质的降解代谢过程中发挥着重要的作用。有研究报道，MA 可抑制MAO 活性，使DA 的代谢受到抑制，导致脑内DA 积聚而产生神经和精神作用[13]。本实验研究发现，与对照组相比，MA 组的DA 与5-HT 表达均呈一致性增加，而MAO 在不同脑区的酶活性表达存在一定的差异，在前额叶皮质中MAO 表达降低，在伏隔核及中脑腹侧被盖区中MAO 表达增加，表明DA、5-HT 及MAO 表达可能与MA 的CPP 效应有关，同时，提示药物在不同脑区中作用存在差异性以及MAO 在不同脑区存在一定的表达差异。MAO 分解DA 产生氧活性代谢产物，氧化应激导致DNA、蛋白质等的损伤和功能丧失，为神经毒性的重要机制[14]。本实验MA 组的MAO 与DA、5-HT 的表达趋势基本相同，可能此给药方式没有造成严重的神经毒性。Morgan 等[15]表示小剂量的MA 或KET 多次滥用很少产生神经毒性。提示本实验可能表现为轻微的神经递质变化和大鼠的成瘾效应，但没有引起显著的毒理性改变。通过与MA 组对比发现，联用组的DA、5-HT 及MAO 表达均呈一致性降低，结合行为学实验结果表明DA、5-HT 及MAO 的表达水平与联用组的CPP 效应没有显著提升有关，可能是动物行为学改变的神经生物学机制之一。

综上所述，DA、5-HT 及MAO 在甲基苯丙胺与氯胺酮成瘾中发挥着重要作用，甲基苯丙胺与低中剂量氯胺酮单用及联合都可形成明显的CPP 效应，但联合给药相对于单独用药，这种CPP 效应并没有显著提高，同时，联合滥用大鼠脑内DA、5-HT 及MAO 的表达较单独MA 给药的水平降低，提示DA、5-HT 及MAO 表达降低与联用组的CPP效应没有显著提高有关，其中的作用机制及甲基苯丙胺与氯胺酮联合滥用致成瘾的机制仍需进一步研究。