植物多酚基元辅助递送siRNA的构效关系研究

沈 扬,朱 方,沈湾湾,范倩倩,李乙文,程义云,3

(1.华东师范大学生命科学学院,上海市调控生物学重点实验室,上海 200241;2.四川大学高分子科学与工程学院,高分子材料工程国家重点实验室,成都 610065;3.华南理工大学分子科学与工程学院,华南软物质科学与技术高等研究院,广州 510640)

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指通过外源和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的一种手段[1,2].自2001年Elbashir等[3]发现合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)可诱导哺乳动物体内的RNAi作用后,便开启了利用可控制的RNAi进行生物医学研究和新型药物研发的领域[4,5].然而,siRNA分子自身不易穿过细胞膜,作用过程中具有的不稳定性和脱靶效应也阻碍了其有效实现基因沉默[6,7].因此,安全、高效的递送载体是RNAi治疗中的关键一环[2].在现有的基因载体中,病毒类载体能够在多种细胞中实现高效转染,但存在安全风险.非病毒类载体(主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物)往往具有更好的安全性,化学结构清楚,易于化学修饰和大规模制备[8,9].其中,阳离子聚合物近年来已成为载体研究的热点[10～15].然而,对于阳离子聚合物而言,其递送效率与细胞毒性之间往往存在矛盾,即高分子量的阳离子聚合物递送效率高,但同时也会产生较高的细胞毒性; 而低分子量的阳离子聚合物虽然生物相容性更好,但其表面正电荷少,与siRNA结合弱,故而递送效率也较低[16,17].因此,增强低分子量阳离子聚合物与siRNA的结合能力,提高形成复合物的稳定性是该领域亟待解决的问题.

为了解决这一问题,我们[18]提出了在转染过程中加入表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)来辅助低分子量阳离子聚合物递送siRNA的思路.多酚类材料在药物递送领域具有很多独特优势[19,20].天然植物多酚EGCG是茶叶中儿茶素的一种,除了具有抗氧化、清除体内自由基等作用外[21],EGCG还可以通过氢键以及疏水相互作用等与DNA,RNA和蛋白质等生物大分子结合[22～26].首先利用EGCG与siRNA复合形成带负电荷的超分子纳米颗粒,进一步在其表面包裹低分子量的阳离子聚合物.这种利用植物多酚辅助递送的方法使低分子量阳离子聚合物可以在较低的剂量下将siRNA压缩成尺寸均一的纳米颗粒,显著地提高了聚合物载体基因沉默效率.这种方法可以适用于不同结构、不同种类的低分子量阳离子聚合物.同时,由于EGCG是天然绿茶多酚,具有优异的生物相容性,整个复合物制备过程未涉及化学合成,且最终能实现高效、低毒的基因转染,因此有望实现绿色、高效的siRNA递送[25].

虽然已有研究证明EGCG分子在辅助siRNA递送方面的潜力,但其化学结构较为复杂,可进一步在结构上拆分为表没食子儿茶素[(-)-Epigallocatechin,EGC]和没食子酸(Gallic acid,GA)2种植物多酚基元.其中EGC也是茶叶中儿茶素的一种,具有抗氧化、抑制癌细胞等作用,其活性略低于EGCG,有研究也发现EGC可以和核酸G-四链体结构结合[27].而GA能够抑制和杀伤肿瘤细胞,同样具有较强的抗氧化、清除自由基作用,研究发现,具有3个羟基基团的GA可以与H-2铁蛋白结合[28].因此,为了进一步探究植物多酚基元辅助递送siRNA的构效关系,本文研究了EGCG,EGC和GA 3种植物多酚基元在结合核酸的能力和辅助低分子量阳离子聚合物递送siRNA的过程中所起的作用(Scheme 1).

Scheme 1 Schematic description of the structure-function relationship of plant polyphenols in promoting siRNA delivery mediated by low molecular weight polymers

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,纯度98%,美国Sigma-Aldrich公司); 表没食子儿茶素(EGC,纯度98%,上海源叶生物科技有限公司); 没食子酸(GA,纯度99%)和ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,PLL,分子量4224)均购自上海麦克林生化科技有限公司; DMEM培养基和胎牛血清(美国Gibco公司); 荧光素酶检测试剂盒(美国Promega公司); 实验所用细胞株为稳转荧光素酶基因的Hela细胞(Hela-Luc细胞,ATCC),在37 ℃,5%(体积分数)CO2环境下培养; siRNA,siRNA-FAM(5′末端标记羧基荧光素的siRNA,上海吉玛制药技术有限公司),其中靶向荧光素酶的siRNA(siLuc)序列如下:

正义链(5′-3′)CCCUAUUCUCCUUCUUCGCdTdT

反义链(5′-3′)GCGAAGAAGGAGAAUAGGGdTdT

HT7700型透射电子显微镜(TEM,日本Hitachi公司),工作电压为200 kV; Zetasizer Nano ZS90型动态光散射仪(DLS,英国Malven公司),分散介质为水,测量温度25 ℃,温度平衡时间2 min,每组样品测量3次; F-4500型荧光分光光度计(日本Hitachi公司),激发波长为450 nm; 酶标仪(美国Thermo公司),预热30 min以上,波长595 nm.

1.2 实验过程

1.2.1 荧光猝灭实验 将0.5 μg siLuc-FAM分别与2.5 μg EGCG,1.67 μg EGC,0.93 μg GA(EGCG,EGC和GA摩尔比为1∶,1∶,1)于室温下孵育10 min,将同浓度的siRNA-FAM溶液作为对照,测定所得溶液的荧光强度(激发波长450 nm,发射波长475～625 nm).

1.2.2 复合物的表征 将0.5 μg siLuc分别与2.5 μg EGCG,1.67 μg EGC,0.93 μg GA在室温下混合孵育20 min,然后每组分别加入2.5 μg PLL,补充100 μL超纯水,孵育30 min,通过DLS测定复合物粒径(检测前溶液补充至1 mL),通过TEM表征复合物形貌.

1.2.3 基因沉默效率检测 在24孔中培养Hela-Luc细胞12 h(50%汇合度).在检测等摩尔EGCG,EGC,GA辅助PLL递送siRNA的效率时,将0.5 μg siLuc分别与2.5 μg EGCG,1.67 μg EGC,0.93 μg GA在室温下孵育20 min后,加入2.5 μg PLL和100 μL不含血清的培养基,再孵育30 min后,补充150 μL不含血清的培养基.另外制备siRNA-EGC/GA-PLL(1.67 μg EGC,0.93 μg GA)和siRNA-EGCG/EGC/GA-PLL(1.25 μg EGCG,0.835 μg EGC,0.465 μg GA)2组混合实验组,材料加入顺序与前面一致.在检测不同摩尔浓度的EGC辅助PLL递送siRNA的效率时,将0.5 μg siLuc分别与2.5 μg EGCG,不同质量EGC(1.67,3.34,5.01,6.67 μg)在室温下孵育20 min后,加入2.5 μg PLL和100 μL不含血清的培养基,再孵育30 min后,补充150 μL不含血清的培养基.每1种样品均设置3个重复孔.细胞培养基中提前加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液(HEPES)维持孵育液pH约7.4.样品制备完成后,以纯EGCG组为阳性对照,板上空出三孔为空白对照,一起孵育6 h后向培养板中加入500 μL含10%(体积分数)血清的细胞培养基,18 h后处理细胞.

使用荧光素酶检测试剂盒检测Hela-Luc细胞中的荧光素酶活性,使用考马斯亮蓝法测定每孔的蛋白质浓度.荧光素酶活性为相对荧光素酶发光单位/总蛋白质量(RLU/mg protein),以实验组荧光素酶活性相对于未经处理的空白组荧光素酶活性的百分比来表示基因沉默效果.

2 结果与讨论

2.1 植物多酚基元与siRNA的相互作用研究

Fig.1 Fluorescence spectra of siRNA-FAM(a),siRNA-FAM/EGCG(b),siRNA-FAM/EGC(c) and siRNA-FAM/GA(d) complex solutionsMolar ratio of EGC and GA to siRNA-FAM is equal to the ratio of EGCG/siRNA-FAM.

为了进一步探究EGCG,EGC和GA 3种植物多酚基元辅助递送siRNA的构效关系,首先研究了这3种植物多酚基元结合核酸的能力.研究结果表明,多酚分子能够通过协同的氢键和疏水作用结合siRNA,而这种聚集作用会导致修饰了荧光素分子的siRNA(siRNA-FAM)发生荧光猝灭效应.所以可以通过荧光猝灭实验中样品荧光的减弱来比较EGCG,EGC和GA与siRNA相互作用的强弱.如图1所示,在加入了等摩尔的EGCG和EGC后,siRNA-FAM溶液的荧光强度均有显著降低,其中加入EGCG的样品荧光下降程度略高于EGC的,而加入等摩尔GA的样品溶液的荧光强度无显著变化.这个结果显示EGCG和EGC都能够通过氢键和疏水相互作用显著增强与siRNA的结合力,而具有邻苯三酚结构特征的GA却不能通过稳定结合siRNA来实现荧光素的荧光猝灭.与GA几乎不能结合siRNA-FAM相比,EGC和EGCG都具有结合siRNA-FAM形成超分子聚集体的能力,只是EGCG的能力更强一些.EGC与EGCG的分子结构特征均含有间苯二酚基团,同时它们分子的亲疏水平衡性也类似,这些因素或许是多酚基元与siRNA产生较强分子相互作用的核心驱动力.

2.2 植物多酚基元与siRNA形成的复合物研究

为了进一步研究EGCG等3种植物多酚基元辅助阳离子聚合物与siRNA形成聚集体复合物的行为,通过静电相互作用将低分子量PLL包裹在上述EGCG,EGC,GA与siRNA形成的复合物的表面,并借助TEM和DLS对最终的复合物溶液聚集态结构进行了表征.由图2(A)～(C)可见,在低分子量PLL存在条件下,EGCG可与siRNA形成小于200 nm的均一纳米粒子,EGCG的存在显著提高了siRNA与低分子量PLL之间的相互作用,与siRNA有效地结合形成超分子聚集体.而在同等条件下,GA辅助形成的粒子则在500 nm左右,且尺寸分布较宽,稳定性较差,反映了含有邻苯三酚基元的GA分子(分子的亲水性远大于疏水性)并不能与PLL和siRNA一起稳定复合,与2.1节GA分子与siRNA的结合较弱的结果一致.而含有间苯二酚结构的EGC基元辅助PLL与siRNA形成粒子的尺寸为300 nm左右,且具有更均一的形貌,也更接近于EGCG形成的粒子,表明EGC可较为有效地辅助PLL结合siRNA形成均一的纳米颗粒.结果表明,相比于GA,EGC具有更大的与siRNA形成超分子组装体的潜力.为了进一步研究EGC在辅助PLL与siRNA形成纳米复合物的特征,继续研究了不同摩尔量的EGC在辅助PLL与siRNA形成复合物聚集体的水合动力学半径和粒子分散度,如图2(D)和(E)所示,随着EGC摩尔量的增加,纳米复合物的水合半径变小,粒径趋向均一,当EGC摩尔量为对照组EGCG的3倍时,复合物粒径达到最小值.总之,EGCG和EGC均能通过氢键和疏水相互作用增强低分子量阳离子聚合物与siRNA的结合能力,提高形成复合物的稳定性,这是siRNA递送有效性的关键因素.显然EGC的效果比EGCG稍弱,但可以通过增加复合物中EGC的相对量来达到与EGCG相似的效果.

Fig.2 Size and morphology of the as-prepared complexDLS and TEM images of siRNA/EGCG/PLL(A),siRNA/EGC/PLL(B) and siRNA/GA/PLL(C) complexes.(D) Size and particle distribution index(PDI) of the siRNA/EGC/PLL complex prepared at different EGC to EGCG molar ratios.(E) DLS of the siRNA/EGCG/PLL(a) and siRNA/EGC/PLL(b) complexes.The molar ratio of used EGC to EGCG is 3∶,1.

2.3 植物多酚基元辅助PLL递送siRNA的效率比较

利用可以稳定表达荧光素酶的Hela细胞(Hela-Luc)来系统评估3种植物多酚基元与PLL以及siRNA形成的共组装超分子聚集体在递送siRNA到胞内实现基因沉默的效率.如图3(A)所示,在等摩尔的条件下,EGCG具有更优异的辅助PLL递送siLuc的能力,其参与构成粒子的基因沉默效率可达80%左右; EGC辅助递送的能力次之,基因沉默效率约为40%左右; 而GA基本上不具备辅助siRNA递送的能力.与2.1节三者结合核酸的能力,以及与PLL和siRNA共组装形成稳定复合物的能力基本一致.从构效关系来说,由EGCG,EGC和GA在结合siRNA形成超分子聚集体能力的差别可见,植物多酚结构基元上所具有的间苯二酚基团,以及分子整体的亲疏水平衡性可能是决定辅助递送效率的关键因素.进一步研究了几种多酚基元协同辅助递送siRNA在细胞层面的表现.由图3(A)可见,当将siRNA/EGCG/PLL复合物中的EGCG部分替换为EGC+GA混合物时(模拟EGCG降解产物),相应复合物的基因沉默效率显著降低; 而当把复合物中的EGCG完全替换为EGC+GA混合物时,所制得复合物的敲除效率进一步降低.可见,在辅助PLL将siLuc递送到Hela细胞实现基因沉默的过程中,EGCG具有重要的作用,但EGC同样具有提高PLL递送siLuc的潜力,并且在EGCG部分降解时仍可保持一定的辅助效果.此实验结果也提示在长时间使用EGCG辅助递送siRNA时,特别需要注意防止EGCG储存过程中的水解副作用(部分水解产物恰好为EGC和GA),以免影响最终的治疗效果.最后定量探究了不同摩尔数的EGC辅助PLL递送siLuc的效率,实验结果如图3(B)所示,当EGC的用量增至5.01 μg时(EGC/EGCG摩尔比为3∶,1),荧光素酶基因的敲除效率显著增加,达到60%左右,最接近EGCG辅助PLL递送siLuc的效率.可见,也可通过提高EGC在形成超分子聚集体时的使用量来达到较好辅助siRNA递送的效果,有一定的应用意义.

Fig.3 RNAi efficiency of the complexes on Hela-Luc cells(A) Delivery efficiency of siLuc assisted by EGCG(a),EGC(b),GA(c),EGC+GA(d) and EGCG+EGC+GA(e) in the presence of PLL; (B) RNAi efficiency of siRNA/EGC/PLL with different molar ratios of EGC/EGCG.EGCG was shown for comparison.** P < 0.01,*** P < 0.001.

3 结 论

为了探究植物多酚基元辅助递送siRNA的构效关系,研究了EGCG,EGC和GA这3种植物多酚基元在结合核酸的能力和辅助低分子量阳离子聚合物递送siRNA的过程中起到的作用.结果表明,3种多酚基元在结合RNA形成纳米复合物的能力为EGCG > EGC >> GA,通过增加EGC的浓度可实现和EGCG相似的核酸复合效果.研究结果还表明,EGCG辅助ε-聚赖氨酸(PLL)递送siRNA的效率最高,EGC次之,而GA的效率最差.同样可以在递送过程中通过增加EGC的用量达到与EGCG相似的辅助效果.本文工作可为在天然多酚材料库中继续寻找和筛选更多具有与EGCG相似化学结构和辅助递送效用的天然多酚化合物提供思路,进一步为发展出更多安全、高效的RNAi药物提供理论支持.