环糊精基阻抗型传感器的制备及对L-半胱氨酸的识别

付可飞,连惠婷,魏晓峰,孙向英,刘 斌

(华侨大学材料科学与工程学院,分子设计与绿色转化福建省高校重点实验室,厦门 361021)

L-半胱氨酸(L-Cys)是含有还原性巯基的α-氨基酸,是组成生物体蛋白质的重要氨基酸,属于非必需氨基酸[1].L-Cys在机体蛋白质的生物活性调节及细胞抗氧化系统中发挥着不可或缺的作用,生命体内L-Cys的水平异常与肝脏损伤、皮肤病变及神经系统紊乱等疾病相关[2].L-Cys的定量识别方法有高效液相色谱法[3]、光谱法[4,5]和电化学传感器法[6]等.电化学传感器法因其快速、灵敏、成本低、可原位及在线监测等优点而日益受到关注.L-Cys的电化学活性较弱,在其电化学定量识别过程中通常会产生较高的过电位,从而影响手性识别效果.因此,在电化学分析过程中,常采用纳米材料修饰电极以解决其过电位问题[7].电化学阻抗型传感器是借助小幅度扰动的非破坏性检测技术[8],具有优异的选择性与灵敏度,简便、快捷,可实现原位、无损及在线监测,可以拓展到L/D-赖氨酸、D-葡萄糖等弱电活性或者非电活性手性物质的电化学识别研究中[9,10].

环糊精(CD)是经典的手性传感膜制备材料,是由n个α-1,4-D-吡喃葡萄糖苷组成的手性低聚糖分子,按照n的大小(n=6～8)分为α-CD,β-CD和γ-CD.CD的内腔呈疏水特性,外腔呈亲水性,具有合适尺寸和疏水性质的客体分子能够进入其空腔中,形成主客体超分子体系[11,12].层层自组装技术能够得到高度有序的纳米级传感膜结构,膜的厚度、成分、结构和性能可调控,适于在多种基底上修饰[13],该技术因具有简单、高效、稳定及灵活的优势而在手性电化学传感器中应用较多[14,15].

本文利用电化学阻抗谱技术,结合具有丰富手性识别位点的γ-CD膜,构建了高灵敏的γ-CD基选择性阻抗型传感器,以实现对L-Cys的阻抗定量识别.根据量子化学预分析结果推算出能与γ-CD特异结合的潜在弱电活性手性氨基酸,准确提高了该靶标阻抗识别的灵敏度和选择性,并有效应用于实际样品的分析中,为测定弱电化学活性物质的电分析传感器的开发提供了新思路.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

L/D-半胱氨酸盐酸盐购于J&K百灵威科技有限公司;L/D-青霉胺(L/D-Pen)、高型半胱氨酸(Hcy)和α/β/γ-环糊精(α/β/γ-CD)购于阿拉丁试剂有限公司; 其它试剂均为分析纯; 实验用水由Milli-Q 超纯水仪制备; 血清样品由华侨大学校医院提供; 舒邦胶囊由远大医药(中国)有限公司提供.

CHI660E型电化学工作站和CHI920D型扫描电子显微镜(SEM)购于上海辰华仪器公司; S-4800型场发射扫描电子显微镜购于日本Hitachi公司; Nicolet iS 50型傅里叶变换红外光谱仪购于美国Thermo Fisher公司; Milli-Q型超纯水仪购于美国Millipore公司.实验采用三电极体系: 工作电极为直径2 mm的圆盘玻碳电极(GCE),对电极为铂丝电极(Pt),参比电极为银/氯化银电极(Ag/AgCl).

1.2 实验过程

1.2.1 实验方法 电化学阻抗谱(EIS)实验在含有0.1 mol/L KCl的PBS缓冲溶液(pH=7.00)中进行,开路电位下设置频率范围为100 mHz～100 kHz,交流电压振幅为5 mV,所有阻抗数据均用ZSimpWin软件拟合等效电路图并得出电化学阻抗值,等效模拟电路为R(Q(R(QR))).微分脉冲伏安(DVP)实验在pH=7.00的PBS缓冲溶液中进行,电位设置为0～1.0 V(vs.Ag/AgCl,下同),电位增量0.008 V,脉冲宽度0.05 s,脉冲周期0.5 s.循环伏安(CV)实验在含有0.1 mol/L KCl 的pH=7.00的PBS缓冲溶液中进行,电位设置为-0.2～+0.6 V,扫描速率为0.1 V/s.

场发射扫描电子显微镜(FESEM)表征设置加速电压为3.0 kV,样品经过高温真空干燥.傅里叶变换红外光谱(FTIR)实验是将组装至玻碳片上的γ-CD与少量干燥的KBr混合研磨压片,采集4000～ 400 cm-1范围内的数据.扫描电化学显微镜(SECM)表征包含氧化吸附与解吸附实验: 氧化吸附实验在pH=7.00的PBS缓冲溶液中进行,电位设置为0～0.8 V,CV曲线扫描圈数为15圈,扫描速率为0.1 V/s; 解吸附实验在pH=7.50的PBS缓冲溶液中进行,基底电极设置恒电位为-0.8 V,铂探针CV过程的电位设置为-0.8～0 V,扫描速率为0.05 V/s.

Scheme 1 Schematic description of the preparation and sensing of γ-CD-based electrochemical sensor

1.2.2 环糊精基传感器的构建与传感检测 将玻碳电极分别用粒径为1.0,0.3和0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨抛光后,用体积分数50%的HNO3、无水乙醇及水分别超声清洗3 min,至电极表面呈疏水镜面,自然晾干.取150 mgγ-CD溶解于pH=5.00的醋酸缓冲溶液中,定容至10 mL,配制成15.0 g/L的γ-CD储备溶液(pH=5.00),备用.将玻碳电极浸入15.0 g/L的γ-CD溶液(pH=5.00)中,以冰水浴控制温度为12 ℃,放置3 h后取出[15],自然晾干,即得环糊精基传感器.测试前,将该传感器先在PBS缓冲液中通过DVP法使L-Cys电氧化吸附至手性传感膜表面,再置于0.2 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中测定其电化学阻抗谱.传感器的构建与传感过程如Scheme 1所示.

1.2.3 实际样品的测试 血清样品由华侨大学校医院提供.取20 μL血清溶解于10 mL pH=7.00的PBS缓冲液中,加入不同浓度的L-Cys标准溶液,然后进行加标回收实验.将舒邦胶囊用0.1 mol/L盐酸溶液溶解后,离心、洗涤,上层清液用pH=7.00的PBS缓冲液稀释100倍,加入不同浓度的L-Cys标准溶液,然后进行加标回收实验.

2 结果与讨论

2.1 L-Cys的伏安行为

采用循环伏安法探究了L-Cys的氧化还原性质,结果见图1.图1(A)为不同浓度L-Cys的CV响应曲线[16],不同浓度L-Cys位于0.6 V处的氧化峰电流(Ip)与浓度(c)的线性拟合方程为Ip=9.215+352.7c,R2=0.9617; 图1(B)为L-Cys连续施加20次DPV信号所得曲线图.由CV曲线可见,L-Cys仅在0.6 V处出现氧化信号峰,且氧化峰电位随其浓度的增大而逐渐正移,氧化峰电流随着L-Cys浓度的增大而逐渐增大,具有一定的线性关系,这表明L-Cys在未修饰电极上的电化学过程为不可逆过程.由DPV曲线可见,L-Cys在0.6 V处的氧化峰电流(Ip)的相对标准偏差(RSD)为41.96%(n=20),氧化峰电位的RSD为2.65%(n=20),这进一步表明L-Cys在氧化过程中具有较高的过电位,从而不利于电流型传感器对其进行定量识别分析[7].L-Cys在电极表面的氧化机理如Scheme 2所示[17].

Fig.1 CV(A) and DPV(B) responses of L-Cys on GCE

Scheme 2 Oxidation mechanism of L-Cys

2.2 L-Cys在未修饰电极上的阻抗响应

[Fe(CN)6]3-/4-在未修饰电极上的阻抗信号能够随着L-Cys浓度的改变而发生变化,实验考察了阻抗信号与L-Cys浓度的关系,向[Fe(CN)6]3-/4-溶液中加入不同浓度的L-Cys,测定其电化学阻抗信号.结果表明,L-Cys浓度[c(μmol/L)]在0.01～0.1 μmol/L及0.1～1.0 μmol/L范围内,ΔR与L-Cys浓度呈现良好的线性相关性,检出限LOD为8.26 nmol/L(S/N=3).其中,L-Cys浓度在0.01～0.1 μmol/L范围内,ΔRet1与c的线性回归方程为ΔRet1=1370c+8.574(R2=0.9926);L-Cys浓度在0.1～1.0 μmol/L范围内,ΔRet2与c的线性回归方程为ΔRet2=198.0c+135.6(R2=0.9928).

实验比较了不同含巯基物质(D-Cys,Hcy和L/D-Pen)在未修饰电极上的阻抗响应情况,以分析对象L-Cys为基准,用L-Cys的阻抗改变量与其它物质的阻抗改变量的比值(即选择性系数ΔRL-Cys/ΔRother)表示该方法对L-Cys识别的选择性,由此关系可知,选择性系数越高,说明该方法的选择性越好.由表1结果可见,选择性系数均大于1,说明未修饰电极对不同含巯基物质均具有一定的阻抗识别效果,但对L-Cys呈现出最佳的识别效果.这可能是由于该类有机物分子均能够吸附在玻碳表面形成一层弱导电性膜,使[Fe(CN)6]3-/4-在未修饰电极表面的电子传递受阻,其中L-Cys与未修饰电极的弱相互作用最强,使未修饰电极表面的导电性改变最大,阻抗识别效果最好.

Table 1 Selectivity coefficients of various structural analogues on bare GCE

综上所述,L-Cys在未修饰电极上表现出较好的阻抗识别效果,但其特异识别性有待进一步提高.

2.3 SEM与量化模拟分析

2.3.1 SEM分析 SECM利用扫描探针的电化学传感功能,能够以高的空间分辨率进行表面电化学研究[17],在电化学分析中的应用较广.为了考察L-Cys的电氧化产物对传感膜的影响,采用SECM方法对比探究了L-Cys在GCE及环糊精基传感器中的电氧化与解吸附过程[18].

利用CV法分别将L-Cys电氧化吸附至GCE及环糊精基传感膜表面,再于pH=7.50的PBS缓冲溶液中,分别对基底电极(GCE或环糊精基传感器)施加-0.8 V的恒电位,对铂探针施加CV信号,结果如图3所示.由图3(A)和(C)可知,L-Cys在GCE和环糊精基传感器上均于0.6 V处出现氧化信号峰; 由图3(B)和(D)可知,L-Cys在GCE表面解吸附,又在铂探针表面于-0.54 V处生成微弱的新氧化峰信号[19]; 然而,L-Cys在环糊精基传感器表面无对应的解吸附峰产生,可能未发生解吸附过程.这可能是由于环糊精基手性传感膜含有大量羟基,这些羟基与胱氨酸的氨基、羧基之间能够产生稳定的氢键作用,使L-Cys氧化产物不易从手性传感膜表面解吸附,导致环糊精基传感器的阻抗信号发生明显改变.

Fig.3 Electro-oxidation(A,C) and desorption(B,D) on bare GCE(A,B) and γ-CD-based sensor(C,D)

2.3.2 量子化学模拟计算 通过量子化学模拟计算能够研究主-客体分子之间的相互作用关系[20],Cys氧化产物胱氨酸的不同构型与环糊精具有不同的作用关系,通过量子化学计算能够说明环糊精基传感器的选择性特征[21,22].因此,可通过计算比较γ-CD与不同构型Cys氧化产物之间的结合能、氢键差异,揭示环糊精基传感器对于Cys不同构型阻抗识别的内在机制.

图4示出了γ-CD-L/D-Cys的分子轨道图.图4(A)～(F)为γ-CD-L-Cys超分子体系(L体系)中152,369,387,388,389和391这6个分子轨道内的原子发生主-客体相互作用的示意图,经基组重叠误差(BSSE)校正[23,24]后的弱相互作用能EL=-12.6 eV,L体系中L-胱氨酸的O192与γ-CD的O91形成的氢键作用最强,键长为103 pm,键价SL= 0.69.图4中(G)～(L)为γ-CD-D-Cys超分子体系(D体系)中360,367,390,394,396和397这6个分子轨道内的原子发生主-客体相互作用的示意图,经BSSE校正后的弱相互作用能ED=-2.7 eV(约为EL的1/4),D体系中D-Cys的O186与γ-CD的O91形成的氢键作用最强,键长为143 pm,键价SD=0.34.

Fig.4 Molecular occupied orbitals 152(A),369(B),387(C),388(D),389(E),391(F) for γ-CD-L-Cys and 360(G),367(H),390(I),394(J),396(K),397(L) for γ-CD-D-Cys

计算结果表明,L-Cys与γ-CD的手性空间位点更加匹配,L-Cys氧化产物与γ-CD之间的结合力比D-Cys氧化产物与γ-CD之间的结合力强[25].据此推测,与D-Cys相比,由于L-Cys的氧化产物与手性传感膜的氢键作用更强,L-Cys的氧化产物更不易从环糊精手性传感膜表面解吸附,从而导致[Fe(CN)6]3-/4-在手性界面的电子传递受阻,体系的阻抗信号增大,因此L-Cys在环糊精基传感器上具有更好的阻抗识别效果.

2.4 自组装构建环糊精基传感器的条件优化

在自组装过程中,多种因素均会影响环糊精自组装膜的结构,而手性传感膜的性能与结构密切相关,从而能够影响手性传感器对L-Cys的阻抗识别效果.实验考察了环糊精类型、浓度、自组装酸碱条件、温度与时间等因素对阻抗识别L-Cys的影响.在其它条件相同时,以能够引起阻抗最大改变量的条件作为最优条件.

2.4.1 环糊精类型的影响 根据CD含有α-1,4-D-吡喃葡萄糖单元数量的不同(6,7或8),可将其分为α-CD,β-CD和γ-CD,三者的空腔大小依次增大.通过考察L-Cys在不同环糊精构建的传感器中的阻抗响应,可选取最适合的手性传感膜制备材料.实验分别自组装构建了α-CD,β-CD和γ-CD基传感器,并对L-Cys进行阻抗识别检测.由图5(A)可知,L-Cys在3种传感器中的阻抗信号均得到增强,尤其在γ-CD基传感器手性界面的阻抗响应最好,ΔRet最大.这是由于具有手性位点的α-CD,β-CD和γ-CD均有利于L-Cys氧化产物的结合,但γ-CD的空腔最大,与L-Cys氧化产物的结合最稳定,故阻抗响应最好.因此,选择γ-CD作为手性传感膜的制备材料.

2.4.2 环糊精浓度的影响γ-CD作为主体分子,其浓度直接影响对客体分子的富集情况,自组装过程中修饰至GCE表面的γ-CD数量与自组装溶液的浓度有关.分别采用浓度为10.0,12.5,15.0,17.5和20.0 g/L的γ-CD溶液构建环糊精基传感器,并对L-Cys进行阻抗识别.图5(B)示出了L-Cys在不同手性传感器中的阻抗响应,阻抗信号均得到增大,当γ-CD浓度为15.0 g/L时,L-Cys的阻抗响应最灵敏.当γ-CD浓度低于15.0 g/L时,自组装膜较薄,L-Cys的识别位点较少,L-Cys的阻抗响应也较弱; 当γ-CD浓度高于15.0 g/L时,γ-CD堆积导致识别位点数降低,L-Cys的阻抗响应灵敏度反而降低.因此,选择15.0 g/L为γ-CD最佳自组装浓度.

2.4.3 自组装pH的影响 在碱性甚至强碱性条件下γ-CD比较稳定,而在酸性条件下其易部分水解生成葡萄糖和各种链长的低聚糖[15],但该体系存在酸性环境下阻抗信号更高的特殊现象.实验考察了pH=4.00～8.00自组装条件对传感器定量识别L-Cys的影响,图5(C)结果表明,在pH=5.00时,L-Cys的识别效果较好且最稳定.推测在该pH条件下,虽然牺牲了部分γ-CD的稳定性,但弱化了L-Cys(等电点pH=5.02,酸性)在碱性条件下在电极膜表面的静电排斥作用,从而在酸性条件下输出更灵敏的电信号.因此,选择pH=5.00为最佳自组装条件.

Fig.5 Effect of different types of CDs(A),concentrations of γ-CD(B),pH changing(C),temperature changing(D) and assembling time(E) on the γ-CD self-assembly on GCE

2.4.4 自组装温度的影响γ-CD在酸性条件下于100 ℃放置30 min会有一半水解,温度可能影响组装在玻碳电极表面的γ-CD数量、结构状态等,从而影响L-Cys的定量识别效果.实验探究了自组装温度分别为5,12,15,20,30及40 ℃时对L-Cys识别效果的影响.由如图5(D)可见,12 ℃下构建的环糊精基传感器对L-Cys的阻抗识别效果最好; 温度更低时,传感器的使用寿命降低; 温度升高时,γ-CD水解能力太强,不利于L-Cys的定量识别.因此,将12 ℃作为最优自组装温度.

2.4.5 自组装时间的影响 自组装时间能够影响γ-CD的组装量和状态.组装时间过短,手性作用位点不足; 自组装时间过长,可能会使γ-CD堆积,导致手性位点数量反而降低.实验探究了γ-CD自组装时间分别为1.0,2.0,3.0,3.5和4.0 h时对L-Cys识别效果的影响.结果如图5(E)所示,自组装时间为3 h时最有利于L-Cys的定量识别; 当组装时间不足3 h时,表面位点不足; 当组装时间超过3 h时,表面γ-CD发生堆积,反而不利于L-Cys分子进入其空腔内部.因此,选择自组装时间为3 h.

2.5 环糊精自组装膜的表征

2.5.1 环糊精自组装膜的SEM和FTIR表征 采用SEM表征了自组装膜的表面形貌; 通过FTIR表征分析了γ-CD自组装至GCE表面的官能团情况.图6(A)为环糊精自组装修饰后的玻碳电极放大20倍的SEM照片,可见γ-CD以低聚物形式附着于电极表面,自组装手性膜内部具有疏松多孔的结构,这可能与γ-CD分子内部疏水、外部亲水的结构有关.图6(B)所示红外光谱显示,自组装至GCE表面的γ-CD低聚物(谱线b)与γ-CD单体(谱线a)的红外吸收峰位置基本一致,表明γ-CD在组装过程中以氢键为主的分子间弱相互作用力聚集在GCE表面.SEM与FTIR表征结果均说明γ-CD已自组装至玻碳电极表面.

2.5.2 环糊精自组装膜的EIS和CV表征 EIS与CV均能用来表征界面电子的传递情况,界面电子传递速率越快,则EIS的阻抗值越小,CV氧化还原峰电流越强.为了表征γ-CD自组装膜的电子传导情况,将新构建的环糊精基传感器置于[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行了EIS与CV测试.图6(C)显示[Fe(CN)6]3-/4-在环糊精基传感器上的传质阻抗(28970 Ω)比在GCE表面的传质阻抗(2335 Ω)大的多; 图6(D)表明,[Fe(CN)6]3-/4-在修饰传感器界面的氧化还原峰电流信号明显减弱.EIS与CV表征结果说明,环糊精基传感器的手性界面具有阻碍界面电子传递的作用,能够放大[Fe(CN)6]3-/4-于界面处的传质阻抗信号.由此推测,以[Fe(CN)6]3-/4-为氧化还原探针,L-Cys在该手性传感器中的阻抗响应灵敏度可能比在未修饰电极中的高.

Fig.6 SEM image(A) and FTIR spectra(B) of self-assembled γ-CD,EIS(C) and CVs(D) spectra of γ-CD-based sensor and bare GCE

2.6 阻抗识别条件的优化

磷酸盐缓冲溶液(PBS)是常见的生物缓冲溶液,可用于模拟生物分子的存在环境,L-Cys与PBS缓冲液具有较好的相容性,L-Cys在中性条件下即可实现电氧化过程[17],因此,选择pH=7.00的PBS缓冲液作为L-Cys电氧化过程的支持电解质.另外,[Fe(CN)6]3-/4-在含有0.1 mol/L KCl的pH=7.00 PBS缓冲液中阻抗响应较稳定,故以此溶液作为阻抗测试的支持电解质.在此基础上,分别考察了L-Cys的电氧化方式以及[Fe(CN)6]3-/4-浓度对阻抗识别L-Cys的影响.

Fig.7 Effect of different means(A) and concentrations of [Fe(CN)6]3-/4-(B) on the γ-CD-based sensor(A) a.DPV,0—1.0 V; b.stewing 65 s; c.CV,0—1.0 V.

2.6.1L-Cys电氧化方式的影响L-Cys的电氧化过程是其在传感器中阻抗识别的关键步骤,选择合适的电氧化方式有利于提高阻抗响应的灵敏度.在相同条件下分别构建了3组环糊精基传感器,第一组手性传感器在含有L-Cys的pH=7.00 PBS缓冲液中施加DPV氧化信号后,测试EIS信号; 第二组手性传感器在相同的溶液中放置65 s后,测试EIS信号; 第三组手性传感器在相同的溶液中施加CV信号后,测试EIS信号.比较3种电氧化方式的阻抗变化[图7(A)]发现,传感器先扫描DPV,再测试EIS,L-Cys的阻抗响应最灵敏.这可能是由于DPV氧化信号使L-Cys发生电氧化,其电氧化产物与γ-CD以主客体作用形成稳定的超分子体系,而CV电化学过程可能还改变了该超分子体系的其它性质.因此,电氧化方式以DPV为最佳.

2.6.2 [Fe(CN)6]3-/4-浓度的影响 手性传感膜界面的电子传递速率与[Fe(CN)6]3-/4-的浓度相关,因此选择合适的[Fe(CN)6]3-/4-浓度有利于提高L-Cys阻抗识别的灵敏度.分别选取1.0×10-4,2.0×10-4,3.0×10-4,5.0×10-4和1.0×10-3mol/L [Fe(CN)6]3-/4-作为探针溶液,测试了手性传感器在其中的电化学阻抗响应情况.由图7(B)可知,在[Fe(CN)6]3-/4-浓度达到2.0×10-4mol/L之前,随着其浓度的递减L-Cys的阻抗增大,更有利于L-Cys的定量识别; 当[Fe(CN)6]3-/4-浓度低至2.0×10-4mol/L时,L-Cys的阻抗识别效果最好; 之后,进一步降低[Fe(CN)6]3-/4-浓度反而使阻抗谱拟合度变差,定量识别效果不佳.因此,选择2.0×10-4mol/L [Fe(CN)6]3-/4-作为最优测试条件.

2.7 环糊精基传感器对L-半胱氨酸的阻抗识别性能

2.7.1 工作曲线 在最佳条件下构建了环糊精基传感器,并以最优测试条件考察了阻抗值与L-Cys浓度之间的关系.结果表明,L-Cys在环糊精基传感器中的电化学阻抗值的相对标准偏差(RSD)为1.986%(n=10),具有良好的稳定性与重现性.图8(A)和(B)表明,L-Cys浓度在0.1～1.0 μmol/L及1.0～6.0 μmol/L范围内,ΔR与L-Cys浓度呈现良好的线性关系,线性回归方程分别为ΔR1=4127c+1947(R2=0.9154)和ΔR2=345.3c+5490(R2=0.9908); 检出限(LOD)为74 nmol/L(S/N=3).

图8(C)示出了L-Cys浓度在0.1～1.0 μmol/L范围内,L-Cys分别在环糊精基传感器和未修饰电极上阻抗响应的线性关系对比图,可见,L-Cys在环糊精基传感器中的阻抗识别灵敏度更高,是在未修饰电极上阻抗识别灵敏度的近20倍.

Fig.8 EIS(A) and calibration curve(B) for the detection of L-Cys with 0.1—6.0 μmol/L on γ-CD-based sensor and the comparison(C) of calibration curves for L-Cys on γ-CD-based sensor or bare GCE

Fig.9 Impedance responses(A) of various structural analogues on γ-CD-based sensor and selectivity analysis(B) for detection of L-Cys on γ-CD-based sensor and bare GCE

2.7.2 特异识别性 选择性是衡量传感器特异性的一个重要指标.实验通过研究D-Cys,Hcy和L/D-Pen在环糊精基传感器上的阻抗识别效果,考察了该传感器的选择性,并与L-Cys在未修饰电极上阻抗识别的选择性系数进行对比.如图9(A)所示,几种含巯基物质均可以使传感器的阻抗信号增大,但有所差异.图9(B)与表2比较了不同方法对不同结构相似物的阻抗响应情况,可见环糊精基传感器对几种物质的选择性系数均比未修饰电极增大.

在特异性研究中,对D-Cys的阻抗识别效果仅次于L-Cys,未修饰电极对D-Cys的选择性系数为1.179,但环糊精基传感器对该物质的选择性系数为2.301,手性选择性提高了约1倍.据此推测,由于存在分子内氢键作用,L-Cys氧化产物与自组装γ-CD手性传感膜的结合更牢固,从而使[Fe(CN)6]3-/4-在手性传感器界面的电子传递受阻更严重,导致阻抗信号改变明显,与未修饰电极相比,选择性系数提升了近1倍.另外,通过分析L/D-Pen的阻抗响应,发现该手性传感器对L-Pen的阻抗识别效果比D-Pen的效果更好,这与L/D-Cys的阻抗识别的手性规律一致,说明自组装γ-CD手性传感膜具有对L构型的手性分子更匹配的手性识别位点.手性传感器对Hcy的识别效果比未修饰电极的识别效果略有增强,推测是由于环糊精与Hcy之间形成了氢键,识别过程中氢键作用使相关氨基酸较易吸附于电极表面.

Table 2 Selectivity coefficients of various structuralanalogues on γ-CD-based sensor

2.8 实际样品的测定

实验分别测定了人体血清和舒邦胶囊中的L-Cys含量[19],用新构建的传感器采用加标回收法测定回收率.结果如表3所示,该传感器对人体血清中L-Cys含量测定的平均回收率在98.9%～108%之间(n=3),而对舒邦胶囊中L-Cys检测的平均回收率在88.9%～90.6%之间(n=3).可见,该传感器在实际样品的复杂体系中对L-Cys的检测结果切实可靠.

Table 3 Detection of L-Cys in different real samples

3 结 论

基于自组装技术构建了环糊精基阻抗型传感器,运用电化学阻抗法实现了L-Cys的快速定量检测.利用量子化学模拟推演了针对D/L-Cys的电化学传感机制,通过模拟数据获得L-Cys氧化产物与环糊精基手性传感膜之间的弱相互作用能为-12.6 eV,最强氢键键长为103 pm,键价为0.69,且与其异构体存在差异.参考模拟结果对L-Cys进行了实际电化学阻抗分析,在0.1～1.0 μmol/L浓度范围内高灵敏检出L-Cys,检出限达到74 nmol/L(S/N=3),实验结果与模拟数据相吻合.该电分析方法操作简便、成本低廉、电极易于制备、测试重现性好且实际样品检出结果稳定.本文基于模拟分析筛选弱电活性手性化合物,高效构建了新型电化学传感器,为电化学手性识别机制的拓展提供了新思路.