幼鼠非酒精性脂肪性肝炎模型的建立及其肝纤维化特征的研究

武楠，王晓晓，费然，饶慧瑛，魏来，刘峰

（1.北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京 100044；2.清华大学附属北京长庚医院肝胆胰中心，北京 102218）

近年来，儿童非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发病率逐年升高，已成为全球共同关注的公共卫生问题之一［1-5］。中国儿童疑似NAFLD患病率为9.03%［5］。儿童脂肪肝不仅本身是一种潜在的进展性疾病，而且可以同时或者在成年后并发多种严重疾病，特别是糖尿病及心血管疾病，严重威胁其当前和成年后的健康甚至生命［6-8］。因此，必须早防早治，避免脂肪肝向恶性结局进展。NAFLD疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及其相关肝纤维化和肝硬化。但目前儿童NAFLD的发病机制仍不明确，故迄今为止没有有效的药物治疗方案［9-12］。因此，建立合适的动物模型对于研究儿童NAFLD的发病机制、改善诊断以及有效地预防和研究各种药物的治疗作用意义重大。

NAFLD动物模型主要有饲料诱导模型（高脂饮食等）、基因修饰型模型（PTEN缺陷小鼠模型等）、复合性模型（联合饮食和基因诱发模型等）［13-14］。饲料诱导的脂肪肝模型操作方法简便，价格低廉，重复性好，死亡率低，是国内外最常用的造模方法。但是目前以上这些营养模型仅在成年动物身上重现（最常见的喂养开始时间为6～8周龄），对于幼龄小鼠的研究报道较少，因此，建立合适的动物模型对于研究儿童NAFLD/NASH的发病机制和新药研发意义重大。故本研究拟开发表征能够与儿童NASH发展背景的一致的幼年动物模型，以期为研究儿童NAFLD/NASH提供合适的动物模型。同时，本研究拟利用二次谐波（second harmonic generation，SHG）/双光子激发荧光（two photon excited fluorescence，TPEF）显微成像技术自动化评估幼鼠模型肝纤维化进程中胶原的变化特点。

1 材料与方法

1.1 材料

3周龄、4周龄、5周龄和6周龄雄性C57BL/6小鼠，SPF级，购自北京维通利华公司。蛋氨酸胆碱缺乏饲料（methionine-and choline-deficient diet，MCD）购自江苏美迪森公司，普通饲料购自北京维通利华公司。HE染色和天狼猩红染色试剂盒购自北京益利精细化学品有限公司。本研究方案经由北京大学人民医院动物伦理委员会审批（批号：2018PHC026），符合实验动物管理与使用准则。

1.2 动物分组及模型制备

将3、4、5、6周龄小鼠随机分为MCD诱导组和正常饮食对照组。分别在造模0周、4周、6周和8周时处死动物（每个时间点6只），留取血清及肝组织标本。

1.3 血清生化指标检测

采用全自动生化分析仪测定肝功能指标血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）。

1.4 肝组织病理学

用4%多聚甲醛固定肝组织，经脱水、透明、石蜡包埋，制组织切片（厚度4 μm）。常规行HE染色和天狼猩红染色。光学显微镜下观察肝组织学变化，参照NASH临床研究网络（Clinical Research Network，CRN）分期［15］，将肝组织纤维化分为4期（S0～S4）。

1.5 肝组织胶原量化分析

将组织切片脱蜡后，使用SHG/TPEF显微成像设备（Genesis，新加坡Histoindex公司）成像后，软件自动提取并分析100个胶原蛋白参数（包括胶原总定量和不同分区的胶原，如汇管区、中央静脉区和肝小叶）。以造模后不同时间点和不同纤维化分期为标准，进一步采用支持向量机（support vector machine，SVM）算法对样本数据进行分析。

1.6 统计学分析

采用SPSS 10.0软件绘制生存时间Kaplan-Meier曲线，比较采用log-rank检验。计量资料以±s表示，多组间均数比较采用One-Way ANOVA检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同周龄小鼠MCD诱导后的一般状况

正常饮食对照组不同周龄小鼠体质量逐渐升高；而MCD诱导组不同周龄的小鼠体质量逐渐下降，见图1。随着喂养时间延长，正常饮食对照组不同周龄小鼠无死亡，而MCD诱导组小鼠死亡数量增加，各周龄小鼠8周存活率不同，其中3周龄组最低（37.5%），4、5、6周龄组分别为62.5%、87.5%和87.5%，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图2。

2.2 不同周龄小鼠MCD建模后相关生化学指标

与正常饮食对照组相比，随着MCD诱导时间的延长，3、4、5、6周龄MCD诱导组的小鼠ALT和AST水平均逐渐升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图3。

2.3 不同周龄小鼠MCD诱导后肝组织病理学表现

图2 不同周龄小鼠MCD饮食和普通饮食后的生存曲线Fig.2 The survival curve of mice of different ages after administration of MCD diet and normal diet

正常饮食对照组小鼠肝组织结构正常，偶有脂肪变。不同周龄MCD诱导组模型小鼠在MCD饮食4周时即可见肝内脂肪变和散在的炎症，其中以3周龄组脂肪变和炎症明显，并且随着造模时间的延长，各组肝小叶内脂肪变和炎症逐渐加重。同时可见肝内胶原量逐渐增多，肝纤维化进展，见图4。提示3～6周龄各组小鼠在MCD诱导8周后均出现NASH的病理特征。

2.4 不同周龄小鼠MCD诱导后胶原参数特征

用SHG/TPEF显微成像技术分析肝组织内100个胶原参数，包括16个胶原总特征、28个汇管区胶原特征、28个中央静脉区胶原特征、28个肝小叶内的肝窦周胶原特征。对MCD诱导后的不同时间点（0、4、6、8周）进行分析发现，与6周龄组比较，3、4、5周龄组小鼠肝脏胶原分布存在相似性，汇管区胶原量明显高于6周龄组，而中央静脉区和窦周胶原量明显低于6周龄组；各组16个胶原总特征的指标无显著差异，见图5。

各组肝组织纤维化评分结果显示，最大评分为2分，3周龄组偶有3分，同样，随着纤维化分期加重，3周龄、4周龄和5周龄组的胶原分布存在相似性，汇管区的胶原量明显高于6周龄组，而中央静脉区的胶原和窦周胶原量明显低于6周龄组；各组16个胶原总特征的指标无显著差异，见图6。

3 讨论

图3 MCD或普通饮食0～8周后不同周龄小鼠的ALT和AST水平Fig.3 The ALT and AST level of mice of different ages after administration of MCD diet and normal diet for 0 to 8 weeks

近年来，儿童NAFLD患病率显著增高。建立合适的反映儿童NAFLD特征的动物模型，对研究儿童NAFLD的发病机制、药物的筛选等有重要价值。MCD饮食所诱导的肝脏脂肪变性炎症及纤维化等组织病理特征与人类NASH相似，是公认的NASH模型［11］，已广泛用于NASH发病机制的研究。本研究发现，从离乳3周龄幼鼠到6周龄成鼠，MCD诱导后ALT和AST均升高，肝损伤加重，病理上均可观察到脂肪变、炎症和纤维化，提示小鼠NASH模型建立成功。

研究［16-19］表明，SHG/TPEF显微成像技术可以对不同纤维化动物模型、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及NAFLD患者的肝脏组织内胶原成像和定量，并可以对肝纤维化的胶原特征进行分析。本研究中进一步比较了MCD饮食诱导不同周龄小鼠NASH模型的纤维化情况，发现3周龄、4周龄和5周龄幼鼠的MCD模型不同分期和不同时间点的肝纤维化变化有相似性，其汇管区的胶原量明显高于6周龄组，而中央静脉区的胶原和窦周胶原量明显低于6周龄组。SCHWIMMER等［20-23］将儿童NASH分为2种模式，即1型（成人型）和2型（儿童型）。成人型NASH中，脂肪变性、小叶炎症和窦周纤维化有关；儿童型NASH中，脂肪变性不局限于某一特定区域，而是更广泛地分布，且炎症和纤维化的主要部位在汇管区，儿童型通常出现于儿童NASH患者。本研究中对3周龄、4周龄和5周龄幼鼠的纤维化分析结果与儿童型NASH纤维化类似，以汇管区胶原改变为主；6周龄小鼠的纤维化分析结果与成人NASH纤维化类似，以窦周和中央静脉周纤维化为主。进一步从纤维化特征方面提示3周龄、4周龄和5周龄幼鼠适合建立儿童NASH模型。然而，这些儿童和成人NASH的病理差异是否源于这2种类型发育过程中的特定机制尚不确定。

图4 不同周龄小鼠MCD建模不同时间点HE和天狼猩红染色图像 ×200Fig.4 The HE and sirus red staining image of mice of different ages after administration of MCD diet at different weeks ×200

图6 不同周龄小鼠MCD建模不同纤维化分期的胶原分布特征Fig.6 The collagen features of mice of different ages at different fibrosis stage after administration of MCD diet

同时，本研究中也观察到MCD饮食的的缺点是小鼠体质量下降，3周龄组幼鼠MCD饮食至8周时，存活率只有37.5%。提示如果要观察NASH进程及进行机制的分析，需综合考虑存活率和病理特征。

综上所述，本研究发现MCD诱导的3周龄、4周龄和5周龄幼鼠的病理特征与儿童型NASH类似，可为儿童NAFLD的发病机制、诊疗和防治提供合适的动物模型。