加味柴胡疏肝汤调控miR-204影响癫痫小鼠海马神经元调亡与ATG7、LC3Ⅱ的表达＊

汪顺贵，玉 倩，李华霞，李 欢，卢 玲，廖现秋，周艳英，宋 曦，秦红玲，刁丽梅＊＊

（1. 广西中医药大学研究生学院 南宁 530023；2. 广西中医药大学第一附属医院 南宁 530001）

癫痫（Epilepsy，Ep）是以大脑神经元异常放电为特征的慢性反复发作性短暂性脑功能失调综合征[1]。目前，全球约有6800 万人受癫痫困扰[2]，每年每10 万人中有67.77 人新增确诊[3]。癫痫的发病机制仍不明确，临床药物治疗效果欠佳，因此寻求有效的治疗手段已刻不容缓。有研究表明，微小RNA（MicroRNAs；miRNA）与癫痫的发生密切相关[4]，其可以通过调节海马神经元自噬和凋亡，影响癫痫的发病[5-6]。因此，在治疗EP 过程中，调节细胞自噬和凋亡或许可成为更为有效的新的治疗方法。临床及实验探究发现，中西医联合治疗癫痫，可以调高药物的疗效，改善EP 患者的预后及药物的副反应[7]。加味柴胡疏肝汤（Jiawei Chaihu Shugan Tang，JWCHSGT）具有疏肝解郁、化痰熄风的功效，结合前人研究，本课题组前期研究观察发现，JWCHSGT 可以降低癫痫发作频率[8-10]，，预测出其靶基因自噬相关基因7（autophagy related gene 7，ATG7）。本实验通过研究JWCHSGT 干预Ep 小鼠后，观察其自噬相关基因ATG7、LC3Ⅱ、miR-204 的变化及神经元凋亡情况。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性昆明小鼠70只，其中10只备用，SPF级，6～8周龄，体重25～30 g，由广西中医药大学实验动物中心提供（许可证：SYXK桂2009-0001）。

1.1.2 主要药物与试剂

加味柴胡疏肝汤：柴胡15 g、白芍15 g、枳壳（麸炒）10 g、炙甘草6 g、川芎10 g、香附10 g、陈皮（醋炒）9 g、浙贝母15 g、生牡蛎30 g、钩藤10 g、蜈蚣3条。所有药材经广西中医药大学罗耽副教授鉴定为正品，符合2015 年版《中华人民共和国药典》规范，由广西中医药大学第一附属医院药剂科统一采购备用（每单味药要求同一产地、同一质量层次、同一批次），采用自动煎药机煎煮，浓缩至药物浓度500 mg/mL；盐酸匹罗卡品（美国Sigma 公司）、硫酸阿托品注射液（郑州铃锐制药有限公司）、0.9%氯化钠注射液（北京双鹤药业有限公司）、卡马西平片（杭州赛诺菲制药有限公司）制作成混悬液、苏木素染色液、返蓝液、分化液、DAB 显色液、mmu-mir-204 antagomir、mmu-mir-204 agomir、Trizol、miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit、miRcute miRNA Detection Kit、miRcute miRNA isolation kit、TIANScript RT KIT、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）、TUNEL试剂盒等。

1.1.3 主要实验仪器

荧光定量PCR 仪 ABI7500 、生物分光光度计BioPhotometer 、涡旋振荡仪QL-902、光学显微镜BX43、离心机Centrifuge 5415D、摊烤片机KD-T、桌面数显脑立体定位仪、超薄切片机：EM UC7等。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立与分组

本实验的所有小鼠自由饮水，适应性饲养1周后，按随机数字表的法将小鼠随机分为6 组：A:生理盐水组、B:模型组、C:加味柴胡疏肝汤组、D:加味柴胡疏肝汤＋miRNA-204 mimic 组、E：加味柴胡疏肝汤＋miRNA-204 inhibitor 组、F:卡马西平组，每组各 10 只。除对照组外，其余组致痫步骤：先腹腔注射硫酸阿托品17 mg·kg-1，30 min 后腹腔注射盐酸匹罗卡品180 mg·kg-1，给药完毕后，按照经典的 Racine（1972）的实验动物痫性发作标准对动物行为学观察[11]。注射30 min后，对未出现4级以上发作的动物每隔15 min给予首剂1/3剂量的匹罗卡品追加注射，追加注射2次以后未出现4级以上发作的小鼠，视为造模失败，不纳入下一步行为学观察。持续痫性发作达到1 h 后给予地西泮腹腔注射，以终止痫性发作。实验小鼠给药用量及方法参照《现代医学实验动物学》中的标准方程进行计算。灌胃液浓度及等效剂量均参照贺式计量-体表面D2=DIXr2/RI进行合理折算。作如下处理：生理盐水组即对照组：生理盐水20 mL·kg-1·d-1灌胃，灌胃2周；模型组：不予加味柴胡疏肝汤灌胃；加味柴胡疏肝汤组：给予加味柴胡疏肝汤 7 g·kg-1·d-1灌胃 2 周；加味柴胡疏肝汤＋miRNA-204 mimic 组：灌胃中药汤2 周后，在麻醉下通过脑立体定位仪，颅内海马区注射miRNA-204 mimic 2 μL；加味柴胡疏肝汤＋miRNA-204 inhibitor 组：灌胃中药汤2 周后，在麻醉下通过脑立体定位仪，颅内海马区注射miRNA-204 inhibitor 2 μL；卡马西平组：给予卡马西平混悬液30 mg·kg-1·d-12 周。两周后再次使用盐酸匹罗卡品180 mg·kg-1致痫，对照组采用生理盐水代替匹罗卡品。最后取材。将小鼠用3.5%水合氯醛按照1 ml/100g 体重的剂量通过腹腔注射麻醉，进行脱颈椎致死后，剪去头部毛发和头皮，剥开颅骨，钝性分离大脑皮层暴露海马组织，将海马周围的大脑组织分开，最后取下海马保存于液氮中。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测药物干预后小鼠海马miR-204 以及自噬基因ATG7、LC3Ⅱ的表达

取30 mg 海马组织进行液氮研磨后采用Trizol 法提取总RNA，使用超微量紫外分光光度计检测其浓度和纯度，RNA 纯度 A260/A280保持在1.8 ～ 2.2，浓度保持在500～1 000 mg·L-1才可以进行下一步实验，提取的RNA置于-80℃冰箱中保存。采用Takara 反转录试剂盒进行反转录实验，反转录反应体系：①37 ℃60 min;②85 ℃ 5 s。PCR 扩增反应在 96 孔板中进行,每个反应做3个复孔，反应体系为 20 μL：cDNA 2 μL,上下 游 引 物 各 0.8 μL, SYRB Green Mix 10 μL, ROX Reference Dye II 0.4 μL, 去离子水 6 μL。PCR 扩增条件：①95 ℃,30 s;②95 ℃,5 s,③60 ℃,34 s,40个循环。采用 Quantity One 软件进行数据分析，结果采用2-△△CT法进行统计分析。

1.2.3 原位缺口末端标记法（TUNEL）检测药物干预后小鼠海马神经元凋亡情况

切片机将小鼠海马切片5 μm，烤片65 ℃4.5 h;用二甲苯脱蜡浸洗切片2 次，每次5 min；用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3 min；用Proteinase K 工作液处理组织 20 min 在 37°C；PBS 漂洗3 次，每次 5 min；制备 TUNEL 反应混合液，处理组用50 μL TdT+450 μL 荧光素标记的 dUTP 液混匀；而阴性对照组仅加50 μL 荧光素标记的dUTP 液。于组织上加50 μL TUNEL 反应混合液（阴性对照组仅加50μL荧光素标记的dUTP液）于标本上，在避光湿盒中反应37 ℃× 1 h。PBS 漂洗3 次，每次5 min；玻片干后加50 μL converter-POD 于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×30 min。PBS 漂洗 3 次；在组织处加 50～100 μl DAB 底物，反应 15～25 ℃×10 min；PBS漂洗3次；拍照后再用苏木素复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。每张切片选取5 个高倍镜（10×20）视野（共计200～500个细胞），观察小鼠海马C1区凋亡细胞并拍照，计算每100 个细胞内的阳性细胞数。计算TUNEL 性细胞百分率：

阳性细胞百分率＝阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.4 统计学分析

表1 PCR引物序列

本研究采用SPSS 22.0软件统计分析，所有数值用均数±标准差（）表示。符合正态分布时，组内前后差异比较采用配对样本t 检验，组间差异比较采用独立样本t 检验；不符合正态分布采用非参数检验，用中位数和四分位数间距（Md，（P25，P75））表示。P＞0.05 差异无统计学意义，P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 为差异有极显著统计学意义。

2 结果

2.1 加味柴胡疏肝汤对癫痫小鼠海马miR-204 及自噬基因LC3Ⅱ、ATG7表达的影响

与正常组相比，模型组miR-204 表达下调，LC3Ⅱ、ATG7 的表达上调（P＜0.01）；与模型组相比，使用加味柴胡疏肝汤和加味柴胡疏肝汤+miR-204 抑制物后，miR-204 表达上调，LC3Ⅱ、ATG7 的表达下调（P＜0.05）；卡马西平组和加味柴胡疏肝汤+miR-204 模拟物组，miR-204 表达上调、LC3Ⅱ、ATG7 的表达下调更加显著（P＜0.01）。详见表2。

2.2 加味柴胡疏肝汤对癫痫小鼠海马神经元凋亡的影响

TUNEL 阳性细胞为凋亡的海马神经元，光镜下其阳性细胞表现为细胞核内有棕黄色或棕褐色颗粒；正常非凋亡细胞，胞核被苏木素染成蓝色，其大小，形态相对一致。图片生理盐水组（A 组）海马C1 区可见个别阳性细胞，模型组（B 组）海马C1 区可见大量阳性细胞，加味柴胡疏肝汤组（C 组）其阳性细胞较模型组明显减少，加味柴胡疏肝汤＋miRNA-204 mimic 组（D组）阳性细胞较单纯使用柴胡疏肝汤减少，加味柴胡疏肝汤＋miRNA-204 inhibitor 组（E 组）阳性细胞介于C组和D组之间，卡马西平组（F组）阳性细胞较生理盐水组稍有增多，采用单因素方差统计分别对各组TUNEL 阳性细胞数进行比较，结果显示：不同组别的阳性细胞凋亡指数存在明显差异（F=520.65，P＜0.01），进一步进行组间比较发现任意两组神经元凋亡指数均存在明显差异（P＜0.01）。详见图1、表3。

表2 相关基因在不同组小鼠海马中表达量(，n=10)

表2 相关基因在不同组小鼠海马中表达量(，n=10)

注：与生理盐水组相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，有统计学意义；与模型组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，有统计学意义

miR204 1.01±0.07 0.17±0.03ΔΔ 0.31±0.03▲0.58±0.09▲▲0.29±0.03▲0.66±0.08▲▲组别生理盐水组模型组疏肝汤组疏肝汤+miR204模拟物组疏肝汤+miR204抑制剂组卡马西平组ATG7 0.96±0.07 8.78±0.27ΔΔ 3.84±0.85▲2.56±0.85▲5.96±0.63▲1.93±0.32▲▲LC3II 1.03±0.05 6.76±0.46ΔΔ 3.67±0.74▲1.88±0.41▲▲4.82±0.36▲1.59±0.09▲▲

3 讨论

癫痫是人类第二大神经系统疾病，严重影响人类的健康，西药具副作用大，易复发，疗效不稳点等确定，中医利用辨证论治的方法运用不同的方药，对于癫痫患者的调养、服药后副作用及远期预后要优于西医。癫痫，中医称之为“痫病”，《三因极一病证方论·癫痫叙论》认为痫病的病机与肝的疏泄功能异常关系密切，其风、痰、瘀产生均为肝气失于疏泄、条达的病理变化，因而“从肝论治”是治疗痫病的关键所在[9]。柴胡疏肝汤具有镇肝、疏肝、解郁的功效，已有临床研究发现，其用于治疗癫痫具有满意的疗效[12-13]。实验研究研究表明柴胡皂苷，具有抗惊厥和镇静作用，能够减少癫痫患者和动物模型的抽搐、异常脑电、凝视等症状的发生[14-15]。而浙贝母可以下调难治性癫痫大鼠模型的耐药蛋白表达，降低癫痫发作频率[16]。有研究表明，自噬和凋亡作用的过程与中医的阴阳和平衡理论相通，过度或者不足的自噬及凋亡均可以导致疾病的发生[17-18]。

图1 加味柴胡疏肝汤对癫痫小鼠海马C1区神经元细胞凋亡的影响（TUNEL,×200）

表3 加味柴胡疏肝汤对癫痫小鼠海马C1区神经元细胞凋亡指数的影响（，n=10）

表3 加味柴胡疏肝汤对癫痫小鼠海马C1区神经元细胞凋亡指数的影响（，n=10）

注：各组两两比较P＜0.01，有统计学意义。凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数

F值P值520.65＜0.01组别生理盐水组模型组疏肝汤组疏肝汤+miR204模拟物组疏肝汤+miR204抑制剂组卡马西平组细胞凋亡指数/%4.75±0.96 63.75±1.71 40.50±1.29 25.75±3.40 49.25±2.50 8.50±1.29

癫痫的发病机制尤为复杂，近年来发现癫痫所导致的海马神经元损伤与细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）有密切关系[19-20]。PCD 包括凋亡、自噬、程序性坏死、焦亡、铁死亡等，其中细胞凋亡称之为I 型细胞程序性死亡，细胞自噬称之为II 型细胞程序性死亡[21]，这两种是主要的细胞程序性死亡。正常生理性凋亡和自噬对于机体是有利的，而过度的细胞程序性死亡可以导致海马神经元丢失、胶质细胞增生、突触结构或传递异常、炎性反应、血管再生、离子通道的改变等，促使大脑异常放电，诱发癫痫[22-23]。越来越多的研究发现miRNA 在转录后水平调控基因的表达，影响相关自噬、凋亡信号通路，如mTOR、Wnt/βcatenin 等通路参与癫痫的发生[24-25]。研究发现，心肌细胞在缺血缺氧条件下，可以使miRNA-204 表达降低，从而增加LC3-Ⅱ的表达水平，使心肌细胞过度自噬，加重心肌的坏死[26]。miR-204 还可以通过保护海马神经元，抑制癫痫样放电[27]。

本实验发现，癫痫小鼠海马神经元凋亡较正常小鼠明显增加，miRNA-204 下降，且相关自噬基因ATG7、LC3Ⅱ增多；而使用加味柴胡疏肝汤干预过后海马神经元凋亡明显减少，miRNA-204 回升，自噬基因ATG7、LC3Ⅱ降低。同时，本课题组进行了miRNA-204 的抑制及过表达后发现，加味柴胡疏肝汤使miRNA-204 高，升高的 miRNA-204 可以抑制 ATG7、LC3Ⅱ的过度表达，减少神经元凋亡率。综上所述，加味柴胡疏肝汤可能减少神经元的自噬与凋亡，治疗癫痫。