食源性肥胖大鼠模型制备中相关影响因素分析探讨＊

姚俊鹏 ，周思远 ，陈丽萍 ，张 林 ，2，李 瑛 ＊＊

（1. 成都中医药大学针灸推拿学院 成都 610075；2. 成都中医药大学第三附属医院，四川省糖尿病防治中心成都 610041）

有研究发现，中国的肥胖人数位居世界第一[1]。肥胖不仅增加许多致死性慢性疾病的患病率（如癌症和心脑血管疾病），且破坏形体美观，阻碍正常的自我认知与人际交往，给患者的心理健康和生活质量造成很大的影响[2，3]。大量临床实践及实验研究证实，针刺干预肥胖病疗效确切，但其机制研究仍有许多困惑存在，建立合适的动物模型是进一步深入研究针刺疗效机制的重要方法学工具。用于研究肥胖的动物模型中，以食源性肥胖（Diet-induced Obesity，DIO）动物模型与人类肥胖病最具有相似之处[4]，而大鼠因生长发育过程中所体现的大量生物学特性与人类高度相似，实验重复性好，便于组织取材和常规指标监测等，常作为构建DIO 模型的实验动物[5]。

通过回顾众多的肥胖模型研究文献，本研究发现国内外研究者在构建DIO 大鼠模型时，大鼠的选择、饲料配方、喂养方法及造模持续时间等因素各不相同，有时会造成结果差异较大，影响实验的可信度，并妨碍不同研究结果间的比较和分析。除此之外，文献中DIO大鼠肥胖的建模率大多在45%-65%之间：一方面，归咎于肥胖抵抗（obesity-resistance，OR）因素[6，7]的存在；另一方面，则与大鼠选择、饲料配方等多种因素影响有关。前期研究[8]发现，针刺可调控下丘脑自噬水平减轻DIO 大鼠体质量，同时建立稳定可靠的DIO大鼠模型对进一步深入探讨针刺减重的分子机制十分重要。因此，本研究从大鼠选择、饲料配方及喂养方法等方面分析讨论，影响饮食诱导肥胖大鼠模型结果稳定性及可重复性的主要因素，并提出相关造模方案，以期为针刺干预肥胖病的实验研究提供参考和借鉴。

1 DIO大鼠模型建立的影响因素

1.1 大鼠的选择

本研究的实验大鼠由于品系、性别及年龄的差异，各有对应的生理特征及优缺点。根据研究目的选择最合适的实验对象，建立一种最接近人类肥胖的理想动物模型对于研究肥胖病理机制和防治措施有着重要的意义。

1.1.1 品系因素

由于遗传背景的差异，大鼠品系不同是造成实验结果不一致的因素之一。1970 年，密执安大学Schemmel 等[9]研 究 提 出 ，Osborne-Mendel（OM）、Sprague-Dawley（SD）及 Wistar 大鼠致肥胖效果好，而Wistar-Lewis 效果差。大鼠的品系差异在对高脂饲料的敏感性方面有所体现，如用高脂饲料（High Fat Diet，HFD）投食S5B/P1 大鼠时其食欲降低，摄食量减少，体质量增加不显著，而OM 大鼠则偏爱高脂成分、摄食量大，仅用2周即造模成功[10]。Douglas等[11]对OM和S5B/P1 大鼠进行13%和56%脂肪供能饲料的自由选择实验，发现OM 大鼠消耗更多的高脂供能饲料，而S5B/P1大鼠更喜食低脂饲料。根据Osborne-Mendel 大鼠和S5B/P1 大鼠对高脂饲料敏感性的差异，国外学者多运用其进行个体肥胖易感（obesity-prone,OP）和OR的机制研究[12，13]。品系的差异还体现在脂肪堆积效应上，如 Jonatan 等[14]同时利用 SD 和 Wistar 两种品系的大鼠进行实验，发现在同样的条件下，Wistar大鼠不仅肥胖行为学特征出现较早，且体内脂肪堆积较SD 大鼠更为明显，尤其是在附睾脂肪垫。有研究[15]认为，这一现象的发生与SD 大鼠肠道菌群中类杆菌和普氏杆菌的含量较Wistar 大鼠低，但双歧杆菌和乳酸杆菌的含量较高有关。

1.1.2 性别因素

Kang 等[16]发现，在临床上，女性肥胖患者并发糖尿病及心血管疾病的风险较男性更高。在DIO 模型中，性别的差异影响着大鼠对不同营养素的偏爱和响应度。有研究者[17，18]给予大鼠含糖为主的高能饲料，发现雌性大鼠体重组间差异出现时间较雄性大鼠更早，且体重增长量明显高于雄性。Jen KL 等[19]喂食大鼠HFD 11 周，结果显示，雌性大鼠未能引起肥胖评价指标的显著变化，雄性大鼠则在体重、脂肪含量等方面增加显著。这一性别差异现象在后来的研究中[20]得到了重复。可见，雄性大鼠对高脂饲料诱导的增重较为敏感，而雌性大鼠则对高糖饲料响应更佳。DIO 模型的性别差异还体现在脂肪分布的不同，Mayes 等[21]研究报道，雌性肥胖大鼠在皮下及生殖器周围的脂肪垫所占比例大于雄性，而在前肢及内脏脂肪的比例较雄性小。因此，不同性别因素在糖脂响应度和脂肪分布等方面所造成的影响，也是DIO 研究中一个需要注意的方面。

1.1.3 年龄因素

在年龄方面，大多数研究者在大鼠刚离乳，3 周龄左右即开始投放HFD，建模周期在10-16周，致肥率为50%左右。亦有研究者[22]选用7-8 周龄，体质量220 g左右的青年大鼠进行实验，持续8周左右，成功建立营养性肥胖模型。潘玲等[23]则选用体重在430 g 左右的成年大鼠进行研究，4 周时大鼠体重、Lee’s 指数及腹腔脂肪含量组间差异明显，致肥率为60%，8 周达75%，造模时间明显缩短。Sclafani 等[17]研究指出，实验大鼠的生长速度随着年龄的增长而下降，选用处于生长发育旺盛阶段的幼年大鼠开始造模，在建模前期，不论是HFD 组还是投食普通饲料（regular chow diets，RCD）组的体重皆显著增加，这在一定程度上影响了实验造模周期。相反地，发育基本稳定的成年大鼠体重增加缓慢，组间呈现差异的时间缩短，且“饱食中枢”下丘脑腹内侧核（ventromedial hypothalamic，VMH）抑制食欲及体重增加的功能随年龄的增长而下降[24]，这使得相同实验周期内，成年大鼠喂饲高脂饮食的增重效应更加明显。可见，研究者在进行DIO 模型建立时，需要充分考虑在大鼠不同年龄阶段投食对实验结果产生的影响。

1.2 饲料配方

在制备食源性肥胖大鼠模型中，饲料配方的设计非常重要，可以说是模型成功与否的关键。有学者曾尝试采用高碳水化合物饲料或“自助餐”饲料诱导大鼠肥胖模型，但由于效果不佳、配方难以标准化等原因，未被后续研究选用。1959 年，Masek[25]首次通过高脂膳食干预诱导了大鼠肥胖动物模型，并对高脂膳食进行了描述。Buettner 等[26]进一步分析不同脂肪成分对动物模型的影响，得出富含饱和脂肪酸的猪油更容易诱导肥胖。因而，高脂饲料配方中猪油的含量一直是研究者不断探讨的问题。

国外研究者大多选择Research Diets、Harlan Teklad 等公司的高脂纯化饲料，而国内学者多在基础饲料中添加猪油、蛋黄粉、奶粉或胆固醇等成分制成混合高脂饲料，将饲料整体脂肪含量提高到20%-40%。Wang 等[27]将高脂饲料配方中猪油含量设计为20%，造模周期持续12 周，结束时成模率为46%。汤锦花等[28]在实际操作中发现，20%猪油饲料由于含有较高的油脂，饲料松散难以成形，不适于有喜用硬物磨牙习性的大鼠，致大鼠摄食量减少，饲料大量浪费，建模周期长且成功率低，而后将猪油含量减至15%，大鼠适应快，食量增加，仅用8 周实验大鼠肥胖率即为45%。大部分研究者将饲料配方中猪油含量控制在12%，同时添加其他适口成分，这样即维持饲料的硬度又保证脂肪供能比和配方总热卡值，如徐姝迪等[29]适当增加饲料中蔗糖的比例，姚荣英等[30]加入花生和麻油。少数国内学者参照Research Diets 配方设计饲料，如 Shen 等[31]依据 Research Diets-D12492 配方（60%脂供能高脂饲料）设计，Jie 等[32]参考Research Diets-D12451 配方（45%脂供能高脂饲料）等。朱磊[33]将自拟高脂饲料（猪油16.90%、脂肪供能40%）与两种Research Diets 配方饲料进行对比实验，结果显示，D12451 组建模效率最高，6 周建模成功率为40%，10 周达 67%，D12492 组 10 周肥胖率仅为 20%，而自拟高脂饲料组经过10 周的喂养肥胖率为0%。可以看出，不同配方饲料的口感、成型、能量及营养素等均不相同，从而影响到DIO 模型的建模率和操作周期。因此，研究者设计的饲料配方在考虑高脂肪含量的同时兼顾口感及成型，对缩短造模周期、保证整个制作模型的过程更稳定、可靠的进行是十分必要的。

1.3 喂饲方法

在DIO 模型的制备过程中，喂饲方法也占据重要一环，寻找合适的喂饲方法是研究者提高建模成功率需要考虑的问题。Masek 等[25]采用HFD 组大鼠足量、单一投放高脂饲料，全天自由摄食饮水，成为DIO模型建造的经典喂饲方法。而后，各学者在此基础上做了不同程度的改进。杨爱君等[34]为保证每日饲料的新鲜度，采用每日限量投食的方法，参照实验大鼠正常摄食量，所有实验对象按每只13 g/日定量投放，随着鼠龄的增加，投料相应增多。刘晓平等[35]则模拟人类三餐饮食模式，进一步限制投料时间，每日分3 次供给，吃完后不再添加。为使大鼠逐渐适应饲料猪油含量，有研究者[36]将模型组由进食单一高脂饲料变为先喂10%猪油饲料，2 周内逐渐过渡到20%猪油高脂饲料；也有研究者[37]将两种不同脂肪含量饲料在造模周期内前后两阶段分别按比例投放。张建刚等[38]则考虑到大鼠摄食自主性对模型建立的影响，选用模型组同时给予普通饲料和高脂饲料的混合喂养法，由大鼠自主选择进食。曹翠玲等[39]则采取3 天一个循环的交替喂养方式，即模型组大鼠第1 天喂以普通饲料，第2、3 天喂高脂饲料，以此循环，避免大鼠因每天食用高脂饲料而引起的食欲减退。可以看出，研究者在实验中为使大鼠更快的适应高脂饲料，减小长期食用对摄食量的影响而不断改进喂饲方法，因此，选择合适的喂饲方法对DIO 模型的建立也非常重要。

1.4 肥胖抵抗因素

不仅不同品系大鼠对HFD 诱导肥胖的易感性存在差异，亦有研究[40-41]发现，即使是同一品系、性别和年龄的大鼠也仅部分诱导成功，存在部分大鼠体重增长比例相对较低，即肥胖易感和肥胖抵抗现象，同时证实OR 的发生率在30%左右，直接影响DIO 模型建造的成功率。目前，越来越多的研究倾向于在实验中分离出OR大鼠，李晓静等[22]在给予实验组大鼠高脂饲料2-3 周后，剔除体重增长量位于后1/3 的大鼠，与传统造模组相比，实验组致肥率高达66.7%，这表明去除OR 大鼠有助于提高致肥率。也有研究者[42]选取在实验周期内逐步淘汰体重增长缓慢的大鼠的方法，使不同肥胖表型反应得更加准确。那立欣等[43]在研究中指出，剔除OR 大鼠后建造的肥胖模型体重、体脂含量等模型评价指标都显著高于传统模型中的肥胖大鼠，更具典型性和代表性，同时可节省喂养周期内的实验成本。上述研究显示，OR 因素对致肥率的影响是研究者在模型制备中需要考虑到的。

1.5 建模持续时间

DIO模型建立持续的时间一直是科研工作者建立DIO 模型时较为关注的问题，持续时间的不同直接影响着不同肥胖并发症的出现。Andrich等[44]给予Wistar大鼠2周HFD，结果仅体内脂肪含量存在组间差异，体重组间差异不明显，证明2 周不足以诱导DIO 大鼠的出现。部分研究者[34，35]实验周期持续6周，实验组体质量、Lee’s指数和体内脂肪重量均高于RCD 组，肥胖表型明显。Sripradha R 等[45]给予雄性Wistar大鼠10周含脂量30%的高脂饲料，结果发现，高脂饮食导致大鼠血浆中TC、TG、LDL-C 和MDA含量升高，而HDL-C 含量出现显著性下降。Amin 等[46]采用含脂量35%的高脂饲料喂饲大鼠12 周，发现HFD 组大鼠在血液脂代谢紊乱的基础上，进一步出现血浆NO 含量降低，血糖升高和胰岛素抵抗现象。这提示研究者在评估干预措施对营养性肥胖不同继发症的疗效时，一定要考虑模型建立周期的影响。

2 讨论与总结

近年来，随着国内外营养性肥胖患者的不断增多，对肥胖发病机制研究和有效干预措施作用机制的需求愈加迫切。由于建立DIO 大鼠模型涉及多因素影响，致使模型的成功率不高，稳定性及可重复性难以保证，严重影响实验的可信度，且不利于不同研究结果间的比较和分析。基于现有的实验研究，本研究初步分析DIO 大鼠模型建立的相关影响因素（见表1），以期为后续研究提供一些新的思路，见表1。

在大鼠的选择方面，品系对比研究[14，15]表明，Wistar大鼠不论在体质量增加还是体内脂肪堆积都优于同期SD大鼠，且Wistar大鼠被证实对饲料中脂肪含量变化反应灵敏[47]，更适合于DIO 动物模型研究。在大鼠年龄的选择方面，如前所述，成年大鼠体重增长缓慢，同时伴有VMH 功能下降，因此，选用成年大鼠模拟的肥胖模型存在VMH 病变的影响，虽然模型建立周期短、效率高，但产生的肥胖表型不完全由饮食诱导，故不能充分代表单纯的人类营养性肥胖。肥胖流行病学调查[1]显示，约1/2 成年肥胖者有幼年肥胖史。选用离乳3 周龄大鼠造模，未经前置普通饲料干扰，幼年期单纯的高脂饮食引起饮食模式、能量代谢水平等的改变可造成大鼠对高脂食物的感官偏嗜，且程序性影响整个生命进程中机体代谢的调节和体质量的变化，虽然存在相对较长的造模周期，但更全面的模拟了人类营养性肥胖的行为特点和感官特征，故适宜于DIO 模型的实验研究[48]。性别方面，雄性大鼠更适合DIO 模型研究。一方面因为其对饲料中脂肪成分和能量密度变化的高敏感性，另一方面则结合大鼠的生理特点，雌性大鼠在成年早期体重趋于稳定且每4-6 天重复的发情期会影响摄食量，若造模周期较长，雄性大鼠能有更显著的体质量和脂肪含量[49]。

在饲料组成方面，目前国内自制高脂饲料种类较多，配方构成偏重于食物的成型、适口性及能量构成，虽然热卡值高但能量不均衡，且配置中易造成饲料中营养素如蛋白质被稀释，从而导致效果良莠不齐，直接影响建模成功率[50]。Research Diets、Harlan Teklad等公司的高脂纯化合成饲料以蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物盐等不同化合物为原料，按照不同营养素的质量和能量比例进行配置，不仅脂肪供能比高，且注重营养素和能量之间的平衡，使大鼠在满足正常生长发育需求的同时摄取更多的热量来诱导肥胖。综合考虑营养素、能量、口感及成型等因素，并结合朱磊等[33]研究结果，认为脂肪供能45%的Research Diets D12451 更适合于DIO 模型的研究，且配方统一，各研究间可比性更好。

关于喂饲方法的选择，首先需要结合大鼠的摄食规律。DIO大鼠的摄食行为特点常表现为单餐进食量增多和摄食频率减少，进食频率和摄食量在夜晚的开始和接近结束时达到高峰。限制喂饲法在每日投食量上不易把控，且限时、限量的饮食模式难以满足DIO大鼠的单餐摄食量和感官享受[51]。此外，由于同时对空白组的饮食限制，可能会出现较早的组间体重差异，但在周期内HFD 组未摄入足量的高脂饲料，直接影响模型的稳定性及可靠性。因此，每日足量投放，自由摄食仍是首选。其次，需要注意大鼠对HFD 的适应过程。在DIO 模型建立初期和喂食高脂饲料一段时间后，模型组大鼠常会出现食欲较空白组差的现象，此时可根据实验条件，采用不同脂肪含量饲料过渡喂养或短暂RCD与HFD交替喂养的方法，在增进食欲的同时，尽量减少组间喂养方式的差异对实验结果造成影响。混合喂养法虽给予大鼠自主择食的权利，但离乳后暴露于HFD 产生的嗜糖脂性可能造成大鼠日RCD摄取量减少，影响DIO模型的建立。

在肥胖抵抗效应方面，研究者可选择于实验前期2-3 周内剔除体重增长量靠后的大鼠，或在实验周期内逐步淘汰体重增长缓慢的大鼠来确保建模成功率，降低实验成本。但值得重视的是，若进行OP 和OR 的机制研究，则需要注意筛选的时间以及OP、OR模型的评判标准，在实验早期仅能做到初步的分离和筛选，并不能完全保证OP和OR模型的精确性。

在建模持续时间方面，研究者应根据实际研究目的确定模型建立所需时间的长短。研究证实，短期喂养难以充分诱导食源性肥胖模型[44]。有学者[33]提出，喂饲6 周是利用45%脂供能高脂饲料构建SD 大鼠肥胖模型最经济的建模周期，肥胖并发的糖脂代谢紊乱需要9-10 周左右才能稳定形成[42]。若进一步延长造模时间，血液中胆固醇浓度继续升高，极易合并动脉粥样硬化等血管病变，对手术等损伤性操作耐受性差，导致后续基础研究可操作空间小[31]。除此之外，也有学者[52]因成功率不理想而延长建模周期，虽然增加了DIO 模型的数量，但在自由采食情况下，对照组大鼠也会随着时间推移出现体脂积累，向肥胖状态发展，这样降低了建模效率，增加实验成本。所以，当研究者选择延长造模周期时，需要综合考虑研究目的、建模效率、实验成本以及大鼠不断恶化的体质对后续机制研究带来的影响。

表1 食源性肥胖大鼠模型制备中主要影响因素及建模成功率

综上所述，DIO 大鼠模型建立过程中易受多种因素影响，针对上述因素，本研究结合现有实验研究也初步提出了相关建议，但最重要的参考依据还是所要研究的目的，即要根据研究目的来制订具体建模方案。此外，这仅仅只是整个模型建造中影响因素的一部分，对于本研究所发现的其他因素，如DIO 模型的判断标准、实验室喂养环境、光照时间、湿度等有待后期研究进一步查证与规范。因此，充分认识多因素对模型制作的影响，构建稳定、可靠的动物模型并合理应用，才能更好地开展针刺干预肥胖病的基础研究。