H2O2对体外培养视网膜色素上皮细胞中BMP-6及其相关受体的影响△

刘明 杨晓岗 马波 陈丽

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是50岁以上人群视力丧失的重要原因，已成为全球失明的主要原因之一，因此，AMD的防治具有举足轻重的意义[1]。目前认为，AMD的发病机制是由于氧化应激、细胞老化、炎症等因素综合作用所致的，而氧化应激可能是各种因素的共同作用机制[2]。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞是位于视网膜最外层的单细胞层，在AMD的发病机制中起着重要作用，是其发病的中心环节[3]。有研究证明，铁代谢异常与AMD的发病密切相关[4]。而在肝脏中，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-6可调节铁调素进而维持铁的平衡[5]。这些研究均提示，BMP-6可能与AMD的发病有关，在保护RPE细胞方面可能发挥着重要的调控作用。此外，我们既往研究发现，H2O2可引起RPE细胞铁调素水平的下降[6]，而BMP-6是调节铁调素的关键因子[5]。因此，本研究利用细胞培养和分子生物学等技术，在细胞层面观察氧化应激对RPE细胞的损伤作用和对BMP-6及其相关受体的影响，探讨RPE细胞氧化应激损伤的分子机制，为AMD的防治寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞及分组RPE细胞(美国ATCC公司)，常规培养，随机分为对照组、H2O2组、实验组。其中对照组RPE细胞正常培养；H2O2组RPE细胞加入200 μmol·L-1H2O2培养；实验组RPE细胞先加入0.1 ng·L-1BMP-6培养1 h后，再加入200 μmol·L-1H2O2继续培养。

1.1.2 试剂与仪器DMEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Hyclone，美国)；过氧化氢(沪试货号10011208)；BMP-6(PeproTech，美国)；流式细胞仪(型号CytoFLEX，BECKMAN，美国)；酶标仪(Thermo，美国)；细胞凋亡试剂盒(上海翊圣，中国)；活性氧(reactive oxygen species,ROS)试剂盒、DAPI(碧云天，中国)；PCR仪(ABI，美国)；兔多抗GAPDH(杭州贤至，中国)；鼠多抗BMP、兔多抗BMPR1A、兔多抗BMPR1B、兔多抗尤文素(Hemojuvelin，HJV)(Affinity,美国)；HRP标记的羊抗兔二抗(武汉博士德，中国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养RPE细胞常规DMEM/F12培养，次日贴壁生长后更换为无血清培养液培养24 h，取生长状态良好的细胞，制备单细胞悬液，细胞计数板计数，按每孔5×105个细胞接入6孔板，在含体积分数5% CO2的饱和湿度条件下，37 ℃培养细胞密度至70%。按实验设计处理各组细胞。

1.2.2 流式细胞仪检测RPE细胞ROSH2O2组RPE细胞加入200 μmol·L-1H2O2处理12 h后，将对照组与H2O2组用不含EDTA的2.5 g·L-1胰蛋白酶消化细胞，终止消化后EP管收集，1200 r·min-1离心3 min，去上清，加PBS重悬，用PBS将细胞润洗2次后1200 r·min-1离心3 min，按照DCFH-DA细胞ROS检测试剂盒操作说明，去PBS，用无血清培养基11000稀释DCFH-DA，每管加入1 mL，对照加不含DCFH-DA的无血清培养基；37 ℃培养箱孵育20 min，每隔3 min混匀一次；用无血清培养基洗涤细胞3次；流式细胞仪上机检测。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测BMP-6及相关受体mRNA按照RNA提取试剂盒说明书，用Trizol法提取对照组和H2O2组mRNA，-80 ℃冰箱保存备用；按逆转录反应体系，反应条件25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min逆转录合成cDNA；再按实时荧光定量 PCR反应体系，反应条件50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40 个循环。 BMP-6和GAPDH引物序：GAPDH上游引物为5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’，下游引物为5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’；BMPR1A上游引物为5’-GGAGATGGCTCGTCGTTGTA-3’，下游引物为5’-AGTCTGGAGGCTGGATTGTG-3’；BMPR1B上游引物为5’-CCACCACCCTAGACGCTAAA-3’，下游引物为5’-TGCCAACTCGAGTGTTAGGT-3’；HJV上游引物为5’-GATCCCAACTTTACCGTGGC-3’，下游引物为5’-CCACAGAACAAAGAGCCCAG-3’，绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。

1.2.4 TUNEL染色检测细胞凋亡H2O2组和实验组细胞培养12 h后，与对照组一起进行离心收集细胞，PBS清洗1次，重悬，加载在铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，在40 g·L-1多聚甲醛室温中固定30 min，PBS清洗3遍，每次5 min；将爬好细胞的玻片浸入40 g·L-1的多聚甲醛(pH 7.4)溶液中室温固定25 min，随后用PBS洗涤3次，每次5 min；将细胞爬片浸入用PBS配制的体积分数0.1% TritonX-100溶液中10 min(冰上操作)，随后用PBS洗涤2次，每次5 min；用PBS溶液润洗样本，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体，处理后的样本放在湿盒中以保持样本湿润；按15的比例用去离子水稀释5×Equilibration Buffer，每个样本滴加100 μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10～30 min，或者将载玻片放入一个含有1×Equilibration Buffer的缸中，保证缓冲液没过样本，在平衡细胞的同时在冰上解冻Alexa Fluor 647-12-dUTP Labeling Mix；在平衡后的区域周围用吸水纸洗掉100 μL 1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在组织上加入TdT孵育缓冲液；把塑料盖玻片盖在组织上以保证试剂平均分布，在湿盒的底部放上用水浸湿的纸巾，将载玻片置于湿盒内，37 ℃孵育60 min；将湿盒用铝箔纸包裹以避光；然后用PBS洗涤3次，每次5 min ；复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余DAPI；用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.5 Weatern blot检测BMP-6及其受体蛋白水平表达应用组织裂解液裂解细胞提取总蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒通过标准曲线计算出样品的蛋白浓度，对照组、H2O2组、实验组蛋白均取等量(30 μg)，加入上样缓冲液，97 ℃加热6 min变性，冷却后取样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，采用电转仪将蛋白从分离胶转移至PVDF膜上，将PVDF膜放入封闭液(TBST+50 g· L-1脱脂奶粉)中，室温封闭30 min。加入一抗(BMP-6、BMPR1A、BMPR1B及HJV的单克隆抗体)并用封闭液稀释，室温孵育过夜。用1×TBST漂洗5～6次，每次5 min。加入适当比例稀释的二抗，室温孵育2 h。 用1×TBST漂洗5～6次,每次5 min。ECL试剂盒化学荧光法显色，用BandScan分析胶片灰度值对Western blot结果作半定量分析。三组Western blot法测定均实施了3次，测定结果稳定。

1.3 统计学分析所有结果均采用SPSS17.0统计学软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差表示，整体比较采用独立样本t检验或单因素方差分析，组间比较如具有方差齐性采用LSD法，如不具有方差齐性则采用Tamhane法。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 H2O2对RPE细胞ROS的影响对照组细胞内ROS水平为(70.55±7.71)%，H2O2组细胞内ROS水平为(99.25±0.28)%，两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 流式细胞仪检测对照组和H2O2组ROS水平

2.2 H2O2对RPE细胞内BMP-6的影响H2O2组内BMP-6 mRNA水平(0.27±0.05)%相对于对照组(0.95±0.06)%为(0.25±0.12)%，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。在蛋白水平上，H2O2组(0.18±0.05)相对于对照组(0.54±0.07) BMP-6的表达水平明显降低(P<0.05)，见图2。

2.3 BMP-6对H2O2环境下RPE细胞的影响TUNEL染色结果显示，对照组的染色阳性细胞数比例为(8.25±1.06)%，H2O2组为(51.22±8.51)%，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；实验组的染色阳性细胞数为(27.63±5.37)%，与H2O2组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 H2O2对BMP受体mRNA及蛋白水平的影响Weatern blot检测结果显示，H2O2组BMP的BMPR1A、BMPR1B及HJV受体水平均低于实验组与对照组，实验组各受体水平与对照组和H2O2组比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见图4。

图2 H2O2对RPE细胞中BMP-6 mRNA及蛋白水平的影响 与对照组比较，*P

图3 TUNEL检测各组RPE细胞凋亡率(×400;红色为凋亡细胞，蓝色为细胞核) 与对照组比较，*P2O2组比较，#P

图4 H2O2对BMP-6相关受体mRNA及蛋白水平的影响 A:氧化应激对受体mRNA水平的影响；B:Western blot检测结果图；C:氧化应激对受体蛋白水平的影响。与对照组比较，*P2O2组比较，#P

3 讨论

ROS是反映细胞内氧化应激水平的直接指标，ROS增多可导致脂质氧化、蛋白质破碎、交联与聚集，同时还可导致DNA碱基氧化，进一步启动细胞凋亡[7]。人RPE细胞暴露于烟雾环境中可产生大量ROS，同时抗氧化剂水平下降，导致线粒体功能损害，最后引起RPE细胞凋亡[8]。我们研究发现，H2O2可以显著提高RPE细胞内ROS的水平，起到促进氧化应激损伤的作用。既往研究发现，氧化应激可以影响铁调素的水平[9]，而在肝脏中，BMP-6已被证实是铁调素的主要调节因子[10]。我们拟进一步观察氧化应激是否可以影响BMP-6的水平，结果显示，相对于对照组，H2O2组BMP-6 mRNA水平及蛋白水平均明显降低，证实了氧化应激可以通过抑制BMP-6起到氧化损伤的作用。

尽管BMP信号通路在动物胚胎发育、组织分化和细胞增殖中发挥关键作用[11]，但有关BMP信号通路在AMD发病中扮演的角色还有待阐明。我们运用TUNEL染色法观察BMP-6预处理后再添加H2O2处理后细胞凋亡的变化，结果显示，BMP-6可以保护RPE细胞对抗氧化应激损伤，显著降低氧化应激导致的RPE细胞的凋亡。

BMPs可以激活Smad依赖的和多个Smad非依赖的信号通路，直接影响下游基因的转录，它们通过与细胞表面受体结合并形成由两种I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体组成的异四聚体复合物来启动信号转导级联反应[12]。 12种BMP有五种已知的BMPI型受体:激活素受体样激酶1(ACVRL1或ALK1)；1A型激活素受体(ActR-1A或ALK2)；BMP受体1A型(BMPR1A，也称ALK3 )；活化素受体1B型(ACVR1B或ALK-4)和BMP受体1B型(BMPR-1B或ALK-6)[13]。HJV是一种BMP共受体，在青少年血色素沉着症中被破坏时，会导致铁调素严重缺乏和组织铁过表达[14]。HJV选择性结合 BMP受体，作为BMP的共受体可以激活 BMP/Smad 信号通路和铁调素的表达[15]。BMP6-HJV-BMP受体复合物启动磷酸化信号级联，Smad1/5/8 被磷酸化并与 Smad4 结合，形成 Smad 复合物进入细胞核，从而激活铁调素的转录。最新研究表明，肝细胞核因子4α通过灭活肝癌细胞中骨形态发生蛋白途径，特别是通过BMP1A起到抑制Hepcidin的作用[16]。Castoldi等[17]发现，通过抑制miR-122可增加BMPR1A及HJV等控制全身铁水平的基因。氧化应激可下调BMP-6，而添加BMP-6可减轻氧化应激所致的细胞凋亡，因此，我们拟进一步观察氧化应激是通过何种与铁调控相关的BMP受体起到促进细胞凋亡的作用。荧光定量PCR结果显示，H2O2可抑制BMP受体的活性(BMP1A受体、BMPR1B受体及HJV受体)，而添加了BMP-6后可对抗氧化应激对其相关受体的抑制作用。

本研究发现，氧化应激可对RPE细胞起到氧化损伤作用，氧化应激可以下调BMP-6的水平促进细胞凋亡，而BMP-6预处理RPE细胞则可以对抗氧化应激损伤；进一步观察发现，氧化应激可以抑制BMPR1、BMPR1B及HJV受体，而BMP-6则可以对抗这种抑制作用，进一步验证了BMP-6在氧化应激损伤RPE细胞中的作用。但我们实验仅初步探索了氧化应激对RPE细胞造成损伤的机制以及BMP-6对抗氧化应激损伤的结果。氧化应激损伤RPE细胞的具体分子机制以及BMP-6对抗氧化应激损伤的作用仍需进一步的研究。