贵州不同地区番茄红酸理化、风味和细菌群落比较分析

李大飞，赵承鑫，贾利蓉，段飞霞，吕远平，张浩岩

(四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065)

番茄红酸也称红酸汤(酸汤的一种)，是一种以番茄和辣椒为主要原料，以白酒、甜酒和稀饭为辅料，经自然发酵制成的一种特色民族调味料，主要分布在我国贵州省苗族和侗族聚集地。与泡菜、酸笋一样，番茄红酸也是一种典型的乳酸发酵制品，因其独特的风味和丰富的营养，近年来，番茄红酸受到全国各地消费者的青睐。番茄红酸含有大量有机酸，如乳酸、乙酸和柠檬酸等，具有开胃、助消化之功效[1]。同时，番茄红酸含有大量的辣椒碱、番茄红素，具有抗癌、预防心血管疾病等生理作用[2,3]。目前，关于贵州番茄红酸，熊瑛等[4]利用高效液相色谱法对其有机酸进行了检测，结果共检测到5种有机酸；鲁杨对凯里工业和作坊红酸汤的主要营养成分和挥发性成分进行了比较研究，结果显示工业产品中钙、镁、钾等矿物质及柠檬醛、柠檬烯等风味化学物质均高于作坊产品；张璇[5]对贵州红酸半成品的微生物进行培养，结果显示乳杆菌为主要微生物。但关于来自不同地区番茄红酸的理化、风味和微生物多样性的比较分析尚未见相关报道。另外，近年来16S rRNA测序技术成为主流的细菌群落分析手段，与传统的培养皿培养法相比，能够准确地获取更多的细菌群落结构信息[6]。

因此，本研究以贵州凯里、石阡和毕节成熟的番茄红酸样品作为研究对象，依照国标方法分析其基本理化指标，采用高效液相色谱(HPLC)法对有机酸进行测定，使用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法对挥发性成分进行测定，利用16S rRNA对细菌群落结构进行研究，旨在对来自贵州不同地区番茄红酸的理化、风味和微生物多样性进行比较分析，为贵州酸汤的生产和产业发展提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 采样及样品处理

采集贵州凯里市、石阡市和毕节市的成熟番茄红酸样品各3个。采用干冰运输和-80 ℃低温保存备用。

1.2 理化指标分析

pH的测定参考GB 5009.237-2016；总酸的测定参考GB/T 12456-2008中的电极法；氨基酸态氮的测定参考GB 5009.235-2016中的酸度计法；亚硝酸盐的测定参考GB/T 5009.33-2008中的分光光度法。

1.3 有机酸分析

1.3.1 仪器与试剂

Agilent 1260 Infinity II型液相色谱分析仪；Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，4 μm)；草酸、苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸和柠檬酸标品，标品纯度≥98%。

1.3.2 方法

样品处理：先称取5.0 g样品，加入蒸馏水定容至50 mL，再于50 ℃超声处理30 min，随后用快速滤纸过滤，离心处理，吸取上层清液，0.22 μm微孔滤膜过滤。

分析过程：以97.5%的去离子水和2.5%的甲醇混合溶液为流动相，40 ℃柱温，20 min总分析时长。用相同程序分析不同浓度梯度的有机酸混合标品，根据峰面积与实际浓度制作标准曲线。

1.4 挥发性成分分析

1.4.1 仪器与试剂

C4～C25正构烷烃混合标品、20 mL顶空瓶、DVB/CAR/PDMS固相微萃取头及配套手柄、GC-MS(岛津公司)、Rxi-5MS色谱柱(长度30 m，膜厚0.25 μm, 内径0.25 mm)、水浴锅。

1.4.2 分析程序

准确称取各组样品3.0 g于20 mL顶空瓶中。 60 ℃下水浴顶空平衡30 min，然后用萃取头吸附20 min，吸附后进样，测定挥发性成分。

GC条件：氦气流速为1.0 mL/min，起始柱温40 ℃，保持5 min；以5 ℃/min的速度升温至65 ℃，保持1 min；再以3 ℃/min的速度升温至120 ℃，保持1 min；然后以5 ℃/min的速度升温至160 ℃，保持1 min；最后以20 ℃/min的速度快速升温至290 ℃。

MS条件：GC-MS 接口温度 220 ℃；EI 离子源；离子源温度200 ℃；扫描范围30～500 m/z。

1.4.3 定性方法

以C4～C25正构烷烃混合标品计算各峰的保留指数。比对NIST08.LIB数据库，保留相似度≥85，且计算保留指数与数据库中保留指数相差不超过30以内的成分。相似度≥90的成分也予以保留。

1.5 细菌群落结构分析

1.5.1 DNA抽提和PCR扩增

参照E.Z.N.A.Soil DNA Kit (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)说明书对样品进行DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop 2000测定DNA 浓度和纯度；使用2轮引物对 16S rRNA基因V5～V7可变区进行PCR扩增，引物序列见表1。扩增程序：95 ℃ 预变性 3 min，15个循环(95 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，然后在 72 ℃ 稳定延伸 10 min，最后在4 ℃进行保存(PCR 仪：ABI GeneAmp 9700型)。PCR反应体系：5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol/L) 0.8 μL，下游引物(5 μmol/L)0.8 μL， TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng。

表1 PCR扩增引物序列Table 1 The amplified primer sequence of PCR

1.5.2 测序及数据处理

测序步骤参照Illumina MiSeq平台(Illumina,San Diego，USA)标准操作规程使用的UPARSE 软件，对序列进行 OTU 聚类，相似度为97%；使用UCHIME 软件剔除嵌合体。利用RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 对每条序列进行物种分类注释，比对NT数据库，设置比对阈值为70%。

2 结果与分析

2.1理化指标

图1 不同地区番茄红酸基本理化指标对比Fig.1 Comparison of the basic physicochemical indicators of TSS from different regions

由图1 可知，3个地区番茄红酸的pH、总酸、亚硝酸盐均存在显著差异(P<0.05)。pH值从高到低依次为：石阡市(3.79)>凯里市(3.35)>毕节市(3.19)。凯里、石阡和毕节番茄红酸总酸含量(以乳酸计)分别为26.93，20.07，29.02 g/kg，这与pH值的测定结果一致。亚硝酸盐作为发酵食品中严格限量的指标，在凯里、石阡和毕节番茄红酸中的含量分别为2.67，5.49，2.13 mg/kg，均低于GB 2762-2017中对果蔬及其制品的限定(20 mg/kg)。氨基酸态氮含量的大小可以反映游离氨基酸含量的高低，是番茄红酸的重要指标之一。由图1可知，石阡、凯里和毕节3个地区番茄红酸氨基酸态氮含量依次降低，分别为0.3%、0.29%和0.26%，差异不明显。pH和总酸的差异与发酵程度有很大的关系，亚硝酸盐的含量与乳杆菌存在关系，研究表明乳杆菌能够有效地降低亚硝酸盐含量[7]。因此，石阡番茄红酸的亚硝酸盐含量相对更高，可能与其更低的Lactobacillus相对含量有关。

2.2 有机酸

利用HPLC对番茄红酸的有机酸进行测定，共测得7种有机酸，见图2。

图2 不同地区番茄红酸有机酸含量对比Fig.2 Comparison of organic acids of TSS from different regions

由图2可知，乳酸、乙酸、柠檬酸为番茄红酸的3种主要有机酸。凯里番茄红酸的乳酸含量最高，达到24.36 g/kg，乙酸和柠檬酸含量分别为6.68 g/kg和4.75 g/kg。石阡番茄红酸含量最高的有机酸为乙酸(12.53 g/kg)，乳酸和柠檬酸含量分别为8.7 g/kg和8.87 g/kg。毕节番茄红酸含量最高的为乳酸(14.5 g/kg)，柠檬酸和乙酸含量分别为12.75 g/kg和6.45 g/kg。不难发现，虽然3个地区番茄红酸的主要有机酸均为乳酸、乙酸和柠檬酸，但是其比例结构存在差异。凯里和毕节番茄红酸乳酸含量最高，而石阡番茄红酸中乙酸含量最高，原因可能与微生物群落和代谢情况存在差异有关。自然发酵产品中微生物群落结构受地理环境因素影响，而不同微生物的代谢情况差异很大，即使相同的菌株在不同的环境代谢情况同样会存在差异[8]。

2.3 挥发性成分

利用固相微萃取吸附挥发性成分，采用GC-MS对风味成分进行定性和定量分析，见图3。

图3 不同地区番茄红酸挥发性成分对比Fig.3 Comparison of volatile components of TSS from different regions

一共定性出89种成分，包括17种醇、10种酸、34种酯、16种烃、4种酚、3种酮、2种醚、1种醛和2种杂环类化合物，见表2。醇类物质除了与添加白酒和甜酒存在关系外，可能还与酵母的代谢有关。酸类物质是细菌的常见代谢产物，比如乳杆菌属等，除了能够代谢生成乳酸外，也能代谢生成乙酸、柠檬酸等其他有机酸[9]。酯类物质主要是由醇和酸发生酯化反应生成[10]。

表2 不同地区番茄红酸挥发性成分 Table 2 Volatile components of TSS from different regions

续 表

续 表

注：“SI”为相似度；“a”为数据库保留指数；“b”为计算保留指数；“-”表示未检出。

由表2和图3可知，3个地区的番茄红酸挥发性成分构成存在显著差异。醇、酸、酯为凯里和石阡番茄红酸的主体风味，但是构成比例差异显著。而毕节番茄红酸除了含有大量的醇、酸、酯外，还含有大量的烃类物质。烃类物质中的烯萜类，如姜烯广泛存在于生姜等香辛料中[11]。因此毕节番茄红酸的大量烃类成分可能与发酵过程中加入较多的香辛料有关。

2.4 细菌群落结构

图4 不同地区番茄红酸细菌群落对比Fig.4 Comparison of the bacterial communities of TSS from different regions

通过提取番茄红酸中的DNA进行PCR扩增后，利用Illumina测序平台进行测序。测序深度最低为13895条，稀释曲线表明测序深度足够。一共检测到9个门，40个属。由图4可知，从门水平上看，凯里和毕节番茄红酸的优势菌为Firmicutes，其平均相对百分含量分别达到99.21%和98.73%；石阡的番茄红酸优势菌为Firmicutes，Thermotogae，Actinobacteria和Bacteroidetes，其平均相对含量分别为71.48%、13.24%、8.17%和3.82%。从属水平上看，凯里和毕节番茄红酸的优势菌为Lactobacillus，其相对含量达到了99.03%和98.43%；石阡的番茄红酸优势菌为Lactobacillus，Oceanotoga，Corynebacterium和Pediococcus，其平均相对含量分别为62.80%、13.24%、8.17%和6.41%。Lactobacillus和Pediococcus常见于其他乳酸发酵制品中[12]。Oceanotoga作为一类嗜热细菌，常见于煤矿、污泥和海底中，可能与产甲烷等气体相关，而在酸食发酵制品中出现很少[13]。Corynebacterium菌属的某些菌株常用来生产氨基酸[14]。

通过比较可以看出，凯里和毕节番茄红酸的细菌群落结构更加单一，Lactobacillus为绝对优势菌属。而石阡番茄红酸群落结构更丰富，除了Lactobacillus作为优势菌属外，Oceanotoga，Corynebacterium和Pediococcus相对含量同样很高。造成此差异的原因可能是自然环境和发酵工艺存在差异，石阡番茄红酸发酵前期乳酸杆菌相对含量较低，存在大量非乳酸杆菌的大量繁殖[15]。

3 结论

对凯里、石阡和毕节3个地区的番茄红酸在理化指标、有机酸、挥发性成分和细菌群落结构方面进行分析。检测出这3个地区的pH值分别为3.35，3.79，3.19；总酸含量分别为26.93，20.07，29.02 g/kg；亚硝酸盐含量分别为2.67，5.49，2.13 mg/kg；氨基酸态氮含量分别为0.3%、0.29%和0.26%。检测到7种有机酸，分别为草酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。检测到出89种挥发性成分，其中包括17种醇、10种酸、34种酯、16种烃、4种酚、3种酮、2种醚、1种醛和2种杂环类化合物。检测到9个细菌门和40个细菌属。

3个地区番茄红酸的pH、总酸和亚硝酸盐均存在显著差异；醇类、酸类和酯类成分为凯里和毕节番茄红酸的主体挥发性风味成分，石阡番茄红酸除含大量的醇、酸和酯外，还含有大量的烃类；凯里和毕节番茄红酸优势细菌属为Lactobacillus，含量分别高达99.03%和98.43%，石阡番茄红酸优势菌为Lactobacillus，Oceanotoga，Corynebacterium和Pediococcus，其平均相对含量分别为62.80%、13.24%、8.17%和6.41%。