IL-17A敲除对帕金森病模型小鼠神经退变及神经炎症的影响*

王金今，何润超，张 倩，郑 娜，彭聿平*

(南通大学医学院生理学系，南通 226001)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)又称震颤麻痹，是一种常见的随年龄增长发病率逐渐增加的神经退行性疾病，其特征性的病理改变为中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺能神经元细胞的进行性凋亡和坏死[1-2]；临床典型症状表现为运动迟缓、静止性震颤、肌强直、自主神经功能障碍、精神障碍等[3]。该病的发生与年龄老化、遗传因素、环境毒物、感染、氧化应激及自由基的形成等多种因素有关[4]。

目前PD的确切病因尚不明确，研究[5]表明白细胞介素(interleukin)-17A是一种促炎因子，与多种自身免疫疾病有关，可能也参与了PD发病的机制。20世纪80年代初发现了一种噬神经毒物—1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)，可诱发人出现PD典型的临床症状，且用MPTP诱导的动物模型会出现与PD患者相似的病理特征[6]。因此，本研究利用IL-17A基因敲除的PD模型小鼠，用MPTP进行造模，探索IL-17A基因敲除对PD模型小鼠神经退变和神经炎症的影响，为PD的发病机制和防治措施提供新的线索。

1 材料和方法

1.1 实验动物 无特定病原体(specefic pathogen free,SPF)级8～12周龄C57BL/6雄性小鼠，体质量20～30 g，购自南通大学实验动物中心；IL-17A基因敲除的小鼠购自南京大学模式动物研究所，在南通大学实验动物中心SPF级屏障环境设施内饲养并造模。用Southern Blotting法鉴定小鼠的基因型。本实验经南通大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 MPTP粉末、抗β-actin单克隆抗体购于Sigma公司；IL-17A基因引物购于Invitrogen公司；琼脂糖、EB购于GENERAY公司；Proteinase K购于TaKaRa公司；Prestained Protein Lad der购于Ther-mo Fisher公司；TUNEL试剂盒购于Roche公司；抗CD11b单克隆抗体购于Abcam公司。

1.3 主要仪器 Rotor-Gene3000型实时荧光定量PCR仪购于Corbett Research公司；凝胶图像分析系统：ShineTech GelAnalyse 2.3购于上海小源科技有限公司；CM1900型冰冻切片机购于德国Leica公司；4 ℃冰冻离心机Beckman 21R型购于美国Beckman公司；9120型Odyssey双红外激光扫描仪购于美国LI-COR，Inc。

1.4 实验方法

1.4.1 鉴定基因敲除小鼠 (1)提取DNA：①剪5 mm鼠尾置1.5 mL离心管中，加蛋白酶K等裂解液裂解；②离心，4 ℃，12 000 r/min，10 min；③取上清加异丙醇，离心，4 ℃，12 000 r/min，10 min；④弃上清，加70%乙醇溶液，7 500 r/min，5 min，4 ℃离心；⑤弃上清，加双蒸水溶解，4 ℃保存。(2)配制聚合酶链式反应(polymerase chein reaction,PCR)扩增体系进行扩增：鉴定IL-17A基因敲除小鼠，见图1。(3)琼脂糖凝胶电泳检测：①制备琼脂糖凝胶；②上样；③电泳：恒压110 V，35 min；④扫凝胶显影，见图1。

1.4.2 PD模型小鼠的制备 (1)将小鼠随机分为3组：注射生理盐水的对照组，野生型PD模型组，IL-17A-/-的PD模型组。(2)造模组的小鼠，腹腔注射MPTP(20 mg/kg)，每隔2 h注射1次，共注射4次，第7天处理。

1.4.3 切片制备及染色 (1)取小鼠全脑并固定：①腹腔注射麻醉剂；②经小鼠心脏左心室灌注生理盐水，在右心耳剪一小口，待肝脏颜色变浅，灌注4%甲醛，20 min；③取脑置4%甲醛中固定，再放入不同浓度的蔗糖溶液进行脱水。(2)切片制备：①冰冻切片机预冷；②PBS包埋；③做连续冠状切片，置于PBS中浸泡，4 ℃保存。(3)TUNEL染色：取若干小鼠脑片，封闭30 min；PBS洗3次，5 min/次；将脑片置于TU-NEL试剂中，37 ℃孵育2 h；PBS洗3次，5 min/次；(4)CD11b染色：取若干小鼠脑片，封闭30 min；PBS洗3次，5 min/次；将脑片置于大鼠抗CD11b单克隆抗体(1∶200)，4 ℃过夜；PBS洗3次，10 min/次；将脑片置于TBST稀释的小鼠抗大鼠抗体(1∶500)，室温孵育4 h；PBS洗3次，10 min/次；(5)将脑片贴在玻片上，在荧光显微镜下观察；(6)TUNEL染色进行凋亡细胞的计数。

1.4.4 Western Blot (1)样品制备：①提取各实验组小鼠的黑质部位并进行称重；②加入组织裂解液进行匀浆；③收集裂解后的组织，4 ℃离心，12 000 r/min，10 min；④取40 μL上清，加10 μL DTT，50 μL 2×buffer，吹打混匀；⑤煮蛋白10 min，-20 ℃保存。(2)电泳：①制备12%分离胶，异丙醇压胶，室温凝固30 min；②弃异丙醇，用双蒸水清洗；③制备上层胶，室温凝固30 min；④上样电泳：按顺序加蛋白，100 V电压，90 min；⑤转膜：裁剪PVDF膜和分离胶，依次将浸泡好的海绵、滤纸、胶、PVDF膜放于转膜板中，300 mA，转膜2 h。(3)蛋白孵育：①于5%脱脂奶粉配好的CD11b一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜；②洗膜3次，10 min/次，置于TBST配好的荧光标记的小鼠抗大鼠IgG(1∶5 000)，室温孵育2 h；③洗膜3次，10 min/次。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据均以表示，细胞数目的统计运用t检验分析比较，Western Blot结果运用单因素方差分析进行处理，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠中脑黑质部位细胞的凋亡 TUNEL染色结果显示，与对照组比较，野生型PD模型组小鼠黑质部位细胞凋亡明显增多；与野生型PD模型组比较，IL-17A-/-的PD模型组小鼠黑质部位细胞凋亡减少，见图2。

2.2 小鼠中脑黑质部位小胶质细胞的形态 CD11b染色结果显示，与对照组比较，野生型PD模型组小鼠黑质部位小胶质细胞胞体明显增大，突起明显消失，细胞呈“阿米巴样”形态；与野生型PD模型组比较，IL-17A-/-的PD模型组小鼠黑质部位小胶质细胞的激活被抑制，胞体轻微肿胀，见图3。

2.3 小鼠中脑黑质部位小胶质细胞的表达 与对照组比较，野生型PD模型组小鼠黑质部位小胶质细胞CD11b蛋白表达增多；与野生型PD模型组比较，IL-17A-/-的PD模型组小鼠黑质部位小胶质细胞CD11b蛋白表达减少，见图4。

3 讨论

随着社会老龄化的发展，PD的发病率逐年增多，仅次于阿尔茨海默病[7]。在1988年，P.L.MCGEER等[8]在PD患者的中脑黑质致密部中首次发现了活化的小胶质细胞。近年来越来越多的研究[9]证实，小胶质细胞的激活与PD的发病机制有关，小胶质细胞作为脑内的固有免疫细胞，在中脑部位分布最密集，占神经胶质细胞的10%左右，与T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞及其他循环系统来源的白细胞共同参与神经损伤后的免疫反应。正常情况下，静息状态的小胶质细胞呈分枝状具有免疫监视作用，清除外来异物和细胞碎片，而病理情况下，小胶质细胞被激活，其形态和功能发生了改变，细胞呈阿米巴样，具有吞噬功能，可以产生自由基、超氧化物阴离子、一氧化氮、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、神经生长因子等多种物质，作用于神经系统，导致多巴胺能神经元细胞变性坏死，加剧脑内的炎症反应[10]，且小胶质细胞的活化状态与脑内受损部位的严重程度密切相关。

此外，有研究[11]在PD患者中脑的黑质致密部发现了CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的浸润，T淋巴细胞可通过血脑屏障并使其遭到破坏，从而发生特异性免疫反应，这些免疫反应产生的淋巴细胞可进入中枢神经系统，造成中枢神经免疫系统破坏[12]。CD4+T细胞具有促炎表型，能促进小胶质细胞的活化和多巴胺能神经元的变性[13]，原始的CD4+T细胞在接受抗原提呈刺激后首先分化为Th0细胞，然后分化为Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞等多种细胞亚群。Th17细胞具有很强的致炎作用，主要分泌IL-17、IL-21、IL-22、IL-26和TNF-α 等多种细胞因子，参与固有免疫和某些炎症的发生。在多发性硬化症患者及其动物模型中Th17细胞可通过血脑屏障的内皮细胞高表达颗粒蛋白酶B，进而杀伤神经元，促进中枢神经系统炎症的发生，且IL-17和IL-22受体在损伤内皮细胞上表达[14]。IL-17由Th17细胞产生，是Th17细胞的主要效应因子，是T细胞诱导炎症反应的早期启动因子，该家族包括6个成员的配体(IL-17A～IL-17F)和5个受体(IL-17RA～IL-17RD和SEF)，它可破坏血脑屏障进入炎症反应部位，通过诱导其他炎症细胞，促进炎性因子的分泌，构成中枢神经系统局部炎症环境。研究[15]表明PD患者外周血免疫细胞的数量和活性发生改变，IL-17A是最先发现的IL-17家族成员，也是该家族的标志性细胞因子，多种自身免疫性疾病的发生与IL-17A的表达异常有关。我们假设脑内炎症反应主要是由IL-17A引起的，脑内活化的小胶质细胞和侵入脑内的Th细胞，两者相互作用促进了PD的发生和发展。

本研究采用了IL-17A基因敲除的小鼠，对其进行PD造模，进而发现，与野生型PD模型组小鼠相比较，IL-17A-/-的PD模型组小鼠中脑黑质部位细胞凋亡减少，小胶质细胞的形态改变较轻且CD11b蛋白表达相对减少。这些结果表明，IL-17A基因敲除对MPTP诱导的小胶质细胞激活的形态和功能的损伤具有抑制作用，减轻了小胶质细胞激活的状态。IL-17A是通过何种机制参与PD的发生和发展目前尚不明确，IL-17A可能是与脑内某些细胞表面的相应受体结合，进而造成炎症损伤，我们将会对这个问题展开进一步的研究。PD患者中枢与外周的免疫失衡与发病有重要的联系，黑质纹状体中MPTP和脂多糖等免疫炎症指标呈高表达，且黑质区有T细胞异常聚集，表明免疫炎症反应会引起机体免疫的失衡[16]。随着对免疫系统认识的不断深入，免疫系统对PD发病机制的影响会越来越明确，进而为PD的治疗提供新的思路。