α-突触核蛋白的突变体A53T对小胶质细胞激活的影响*

何润超，王金今，张 倩，郑 娜，彭聿平*

(南通大学医学院生理学系，南通 226001)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是最常见的神经退行性疾病之一，其临床症状包括运动迟缓、静止性震颤和肌肉强直等多种运动症状，也包括抑郁、胃肠功能和痴呆等非运动症状[1-2]。PD与神经元的丢失和α-突触核蛋白(alpha-Synuclein,α-Syn)的聚集形式积累有关。这些过程是如何联系、如何调节病理中的α-Syn及小胶质细胞的激活很少被研究[3]。因此，本研究原代培养小胶质细胞，分别加入2 μmol/L和5 μmol/L的野生型α-Syn(wild type alpha-Synuclein,WT α-Syn)和α-突触核蛋白突变体A53T(alpha-Synuclein mutant A53T,α-Syn A53T)来观察小胶质细胞的形态变化，根据形态变化和CD11b蛋白的表达判断小胶质细胞的激活程度。

1 材料和方法

1.1 实验仪器 BNA-311型CO2细胞培养箱(日本ESPEC公司)；DML型正置生物显微镜(德国Leica公司)；DMIRB型倒置相差显微镜(德国Leica公司)；蛋白电泳仪(上海BIO-RAD公司)。

1.2 药物和试剂 C57BL/6的小鼠(南通大学实验动物中心)；重组人的WT α-Syn和重组人的α-Syn A53T(rPeptide公司)；DMEM-F12粉末(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素和链霉素(Sigma公司)；大鼠抗小鼠CD11b单克隆抗体(上海BIO-RAD公司)；小鼠抗β-actin单克隆抗体(Sigma公司)；聚丙烯酰胺(上海碧云天生物技术有限公司)；pH 6.8的1 mol/L Tris-HCl(上海碧云天生物技术有限公司)；pH 8.8的1.5 mol/L Tris-HCl(上海碧云天生物技术有限公司)；多聚赖氨酸(Sigma公司)。本实验经南通大学实验动物伦理委员会批准。

1.3 原代小胶质细胞的来源和培养 取10只出生1 d的C57BL/6的小鼠，用75%乙醇棉球擦拭头颈部，取出全脑，浸泡在预冷的含D-Hank′s的皿中，洗去血渍，用显微镊剔除脑膜和血管，剪碎，用滴管将组织块悬液平均吸到2支玻璃离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入2～4 mL的0.125%胰蛋白酶，吹打混匀，37 ℃水浴消化15 min；胎牛血清和DMEM-F12基本培养基按体积比1∶9的比例配成完全培养基，待组织块消化好之后加入等体积的完全培养基，吹打混匀终止消化，1 500 r/min离心5 min，吸弃上清，加入2～4 mL的完全培养基至2支离心管中，吹打混匀成单细胞悬液，用滴管将单细胞悬液转移到小玻璃瓶中，加入完全培养基终体积为30 mL混匀，平均接种到预先用多基赖氨酸包被好的6个25 cm2的细胞培养瓶中。将培养瓶置于5%CO2，湿度饱和，37 ℃的培养箱中。48 h后换液，之后每隔3 d半量换液1次(细胞上清和新鲜的完全培养基等比例混合，加到培养瓶中)，培养至12～14 d，将细胞培养瓶置于摇床上，固定好，240 r/min，4 h。此时，上清中存在大量的小胶质细胞，小胶质细胞的纯度≥95%，收集上清于离心管中，1 500 r/min离心5 min，用滴管收集上清，按上清和新鲜的完全培养基为1∶1配成适量的培养基备用。加入2 mL配好的完全培养基，重悬细胞，转移到无菌的玻璃瓶中，取一灭菌1.5 mL EP管，加入900 μL完全培养基和100 μL单细胞悬液，充分混匀，吸取10 μL于细胞计数板上，在显微镜下细胞计数，用配好的培养基调整细胞密度，按1×106/mL的细胞密度，接种到六孔板中，2 mL/孔；按1×105/mL的细胞密度，接种到24孔板中，500 μL/孔。将接种好的孔板放置在培养箱中，每隔3 d半量换液，10 d之后加药处理。

1.4 Western Blot按要求提取蛋白质，配置10%的蛋白电泳胶，待胶凝固好后，按要求上样，电泳条件：积层胶恒压80 V，时间20 min；分离胶恒压120 V，时间75 min。提前准备好相应大小的PVNF膜。电泳好之后切胶，组装好转膜夹板，将转膜槽放在冰上进行转膜(恒流300 mA时间2 h)，转膜好后，将PVDF膜放在TBST中漂洗5 min，然后用5%的脱脂牛奶室温封闭30 min，用TBST按1∶1 000的比例稀释CD11b的一抗，将膜放在稀释液上，4 ℃孵育过夜(＞16 h)，兔来源的红色荧光二抗室温避光孵育2 h，用TBST洗膜3次，5 min/次，扫膜，使用ImageJ电脑软件进行定量分析。

1.5 免疫荧光染色 将带有接种好小胶质细胞的小圆玻片的24孔板取出，弃上清，用0.01 mol/L PBS溶液清洗3次，固定、封闭，加入稀释比例为1∶200的免疫组化的CD11b的一抗稀释液，200 μL/孔，4 ℃孵育过夜(＞16 h)，回收一抗，用0.01 mol/L PBS清洗3次，加入按1∶200的小鼠绿二抗稀释液，200 mL/孔，室温避光孵育2 h，回收二抗，PBS洗玻片3次。按1∶1 000的比例稀释Hoechst，每孔加入200 μL，37 ℃温箱避光孵育10 min，回收Hoechst染液，清洗3次，即可在荧光显微镜下观察，用Photoshop软件处理染色图。

1.6 统计学方法 采用Graphpad 7统计软件分析，数据均以表示，各组之间比较采用单因素分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 α-Syn对小胶质细胞形态的影响 免疫荧光结果显示，与对照组相比，2 μmol/L浓度的α-Syn小胶质细胞的突起无明显收缩，胞体无明显增大；而使用了5 μmol/L浓度的α-Syn小胶质细胞突起变短，胞体变大，见图1。

2.2 α-Syn对小胶质细胞表达CD11b的影响 Western Blot结果表明，与对照组相比，使用了2 μmol/L α-Syn，小胶质细胞的CD11b蛋白表达量无明显升高，而使用了5 μmol/L α-Syn时，CD11b蛋白表达量升高，见图2。

2.3 α-Syn A53T对小胶质细胞形态的影响 免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，2 μmol/L α-Syn A53T能激活小胶质细胞，使小胶质细胞突起收缩，胞体变大；而5 μmol/L α-Syn A53T能进一步激活小胶质细胞，胞体进一步增大，见图3。

2.4 α-Syn A53T对小胶质细胞表达CD11b的影响Western Blot结果显示，与对照组相比，使用了2 μmol/L α-Syn A53T，小胶质细胞的CD11b蛋白表达量无明显升高，而使用了5 μmol/L α-Syn A53T时，CD11b蛋白表达量明显升高，见图4。

2.5 α-Syn A53T与α-Syn激活小胶质细胞的作用比较 根据以上免疫荧光染色结果，用不同浓度处理组的平均每个细胞的染色面积分别与对照组的平均每个细胞的染色面积的比值，得出图5A的统计图。根据以上Western Blot结果，用不同浓度的处理组分别与对照组进行比较，得出图5B的统计图。两统计图结果表明，与α-Syn相比，α-Syn A53T对小胶质细胞活化的影响更加明显。

3 讨论

α-Syn是具有140个氨基酸的蛋白质，约占大脑内胞质总蛋白的1%。其在黑质致密部多巴胺能神经元中表达量最高，因此α-Syn可能参与神经递质的释放、突触囊泡的运输、突触功能活动和可塑性[4-7]。α-Syn具有自我组装能力，从未折叠的单体到寡聚体(淀粉样原纤维)，这些不溶性纤维的积累逐渐促进了神经元和胶质细胞内被称为路易体的细胞内包涵体的形成[8-9]。最近研究[10-12]表明，α-Syn寡聚物能与脂质结合，破坏细胞膜的完整性，导致细胞死亡在体外和体内。此外，众所周知，聚合α-Syn出现在路易小体诱导小胶质激活导致多巴胺神经元的死亡[13]。尽管大多数PD病例是偶发性的，但编码α-syn蛋白基因的点突变导致了PD的遗传形式[14]。α-Syn A53T 53位的丙氨酸替代苏氨酸被认为是帕金森病严重常染色体显性特征的原因，其特征是发病早，病程短(＜10年)。随后，鉴定出另外两个点突变，均与显性PD有关：a30p和e46k[15-17]。

PD是组织学上由α-突触核蛋白的沉积和称为路易体的蛋白质聚集体导致小胶质细胞活化，释放大量的促炎因子(细胞因子、趋化因子、前列腺素)，导致神经元的死亡。尽管大多数PD病例是零星的，点突变编码α-突触核蛋白的基因，引起遗传性PD。

自本世纪初以来，一些线索[18-19]已经证明α-Syn可由细胞分泌，并存在于诸如PD患者和健康患者的脑脊髓液、血浆等生物液体中，这种细胞外α-Syn可能通过激活小胶质细胞来启动和维持炎症反应。活化的小胶质细胞从静止的分支形状转变为变形虫形状，伴随着细胞表面受体受损、活性氧产生和细胞因子释放[20-22]。激活小胶质吞噬细胞外源抗原，增殖并招募额外的小胶质细胞来调节炎症反应。尽管这一现象对于对抗感染或脑外伤是必不可少的，但过度激活会导致严重的细胞损伤，在局部放电的情况下，可能导致多巴胺能神经元的消耗[22]。

本研究中，原代培养小胶质细胞分别加入2 μmol/L和5 μmol/L α-Syn和α-Syn A53T，5 μmol/L α-Syn轻度激活小胶质细胞，同时小胶质细胞内的CD11b蛋白表达量升高；2 μmol/L和5 μmol/L的α-Syn A53T，均能活化小胶质细胞，对应浓度的CD11b表达量也明显升高。从免疫荧光染色结果来看，与α-Syn相比，α-Syn A53T激活小胶质细胞更明显，其原因可能是突变的α-Syn A53T 53位的丙氨酸替代苏氨酸，然后翻译后修饰(磷酸化、糖基化、亚硝基化)使结构发生改变，从而影响功能。